李 娜，李向红，刘永乐*，俞 健，王发祥，王建辉

(长沙理工大学食品与生物工程系，湖南 长沙 410004)

提取方法对米谷蛋白分子理化性质的影响

李 娜，李向红，刘永乐*，俞 健，王发祥，王建辉

(长沙理工大学食品与生物工程系，湖南 长沙 410004)

研究不同提取方法对米谷蛋白分子理化性质的影响，采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、体积排阻高效液相色谱（size exclusion chromatography-high-performance liquid chromatography，SEC-HPLC）、扫描电镜和差式扫描量热法对所提取的米谷蛋白分子的性质进行表征分析。结果表明：碱提法结合分步提取以及水洗工艺得到的米谷蛋白，蛋白含量达到（93.42±0.32）%；SDS-PAGE分析显示其主要有3条清晰条带（19、33、50 ku）；SEC-HPLC检测到蛋白体系中的小分子部分和分子质量＞106u大分子部分较少；微观结构观察到其暴露出了蛋白质的骨架结构；同时这种方法所提取得的米谷蛋白焓值最高，热稳定性比较好。

米谷蛋白；提取；分子结构

大米是大部分人能量和蛋白质的主要来源[1]。大米中蛋白质含量（干物质计）为8.2%～15.2%，其氨基酸配比合理，具有高营养价值和低过敏性[2-3]，是谷物蛋白中营养价值较高的一种。稻谷在加工成大米的过程中会产生约15%的碎米；此外，大米淀粉糖生产中的副产品米渣，蛋白质含量也在60%以上[4]。这些都是优质、丰富的蛋白质来源，但多用作动物饲料，其价值远未得到充分利用。利用这些廉价的原料开发优质蛋白，能显著提高大米加工业的产品附加值。

大米蛋白的主要组分是米谷蛋白，占66%～78%[5]。米谷蛋白分子中高含量的谷氨酰胺及天冬酰胺之间通过氢键、疏水作用等聚集成致密分子，形成了一种大分子的蛋白质聚合体[6-7]，造成其溶解度较低，限制了其在食品中的应用。最新研究表明，通过蛋白质谷氨酰胺酶对米谷蛋白脱酰胺能显著改善其溶解度及其他功能性质，并且不会引起蛋白质肽链的水解[8]。然而目前常用的大米蛋白提取方法是碱法和酶法[9-11]，所获得的大米蛋白纯度较低或者分子结构受到了破坏，不利于蛋白质谷氨酰胺酶脱酰胺的作用。在之前研究的基础上，本研究采用碱提酸沉，分别结合分步提取法、多次碱提和水洗等方法提纯大米蛋白，并采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和体积排阻高效液相色谱（size exclusion chromatography-high-performance liquid chromatography，SEC-HPLC）分析所提取蛋白样品的分子质量分布[12-13]，扫描电镜（scanning electron microscope, SEM）观察蛋白质表面结构[14-17]，以及差式扫描量热法（differential scanning calorimetry，DSC）分析蛋白样品的热稳定性[18-19]，探讨不同的提取方法对米谷蛋白分子理化性质的影响。通过对现有大米蛋白的提取方法进行改进，获得纯度较高、分子结构改变较少的蛋白底物，以利于酶法脱酰胺的顺利、高效进行和后续改性研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

碎米（大米加工副产物），由湖南霞凝粮库提供。

1.2 仪器与设备

DELTA320型pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；LD5-10型台式低速离心机 北京京立离心机有限公司；FD-1A冷冻干燥机 上海博医康实验仪器有限公司；磁力搅拌器 江苏金坛市金城国盛实验仪器厂；JSM-6700F场发射扫描电子显微镜 日本电子公司；DYY-5型稳流稳压电泳仪 北京市六一仪器厂；Q2000差示扫描量热仪 美国TA仪器公司；LC-20A高效液相色谱仪 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理

碎米磨碎成粉，过120目筛，备用。

1.3.2 工艺流程

方法1：碱提→离心→酸沉→离心→洗涤→干燥→大米蛋白（样品1）。方法2：碱提→离心→酸沉→离心→水提→离心→盐提→离心→醇提→抽滤→碱提→离心→酸沉→离心→碱提→离心→酸沉→离心→干燥→大米蛋白（样品2）。方法3：碱提→离心→酸沉→离心→洗涤→水提→离心→盐提→离心→洗涤→醇提→抽滤→洗涤→干燥→大米蛋（样品3）。方法4：碱提→离心→酸沉→离心→洗涤→水提→离心→盐提→离心→洗涤→醇提→抽滤→洗涤→碱提→离心→酸沉→离心→洗涤→碱提→离心→酸沉→离心→洗涤→干燥→大米蛋白（样品4）。

不同方法中提取大米蛋白操作要点如下：

1）碱提：最佳工艺条件均为：NaOH浓度为0.05 mol/L，固液比为1∶10，提取时间为1 h；2)酸沉：碱提分离后获得的上清液中加入0.1 mol/L盐酸，边加边搅拌，直到pH值降到约4.80；3)水提：将酸沉所获得的蛋白质加入去离子水中，固液比为1∶10，时间为1h。在水提时加入0.1 mol/L盐酸，边加边搅拌，维持提取液pH值为7.0左右；4）盐提：将水提所获得的蛋白质加入5%NaCl中，固液比为1∶10，时间为1 h；5）醇提：将经盐提后的大米蛋白加入体积分数为75%的乙醇中，固液比为1∶5，时间为1 h；6）离心：离心机转速为4 500 r/min，离心时间为15 min。

1.4 指标分析

1.4.1 常规成分的测定

蛋白质的测定：GB/T 5511—2008《谷物和豆类 氮含量测定和粗蛋白质含量计算 凯氏法》，氮换算为蛋白质的系数为5.95；水分的测定：GB 5009.3—2010 《食品中水分的测定》；灰分的测定：GB/T 5505—2008 《粮油检验 灰分测定法》；脂肪的测定：GB/T 5512—2008《粮油检验 粮食中粗脂肪含量测定》。

1.4.2 SDS-PAGE分析

用垂直板SDS-PAGE蛋白电泳法，分离胶12%，浓缩胶5%。以相对分子质量1.4×105～6.4×105的标准蛋白为标准，样品用0.05 mol/L NaOH预处理。电泳同时用R250考马斯亮蓝染色5 h左右，脱色至电泳带清晰即可。

1.4.3 SEC-HPLC分析

用磷酸盐缓冲液（2% SDS，pH7.0）来溶解蛋白样品，配制成5 mg/mL的蛋白溶液，离心后取上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤，使用岛津LC-20A高效液相系统与Shodex KW-804蛋白柱。流动相为200 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液（2% SDS，pH 7.0），洗脱速率1 mL/min，在220 nm波长处检测洗脱液，柱温为25℃。用于Shodex KW-804蛋白柱曲线校正的10种标准物质分别是：甲状腺球蛋白（669 000 u）、醛缩酶（158 000 u）、牛血清白蛋白（67 000 u）、卵白蛋白（43 000 u）、过氧化物酶（40 200 u）、腺苷酸激酶（32 000 u）、激血球素（17 000 u）、核糖核酸酶A（13 700 u）、aprotinin（6 500 u）和VB12（1 350 u）。根据10种标准样品绘制Shodex KW-804蛋白柱的标准曲线见图1。

图1 Shodex KW-804蛋白柱的标准曲线Fig.1 Standard curve prepared using Shodex KW-804 protein column

1.4.4 SEM分析

取适量干燥后样品，分散在SEM样品台上，通过离子溅射在样品上喷金后，用扫描电子显微镜观察形态结构。

1.4.5 DSC热性质分析

使用DSC对蛋白质进行热性质分析。取2.5 mg大米蛋白样品放入铝盘，温度扫描范围30～120℃，升温速率5℃/min。采用空密封铝盘作为参照。实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 米谷蛋白的成分分析

表1 4种不同工艺获得的米谷蛋白的成分分析Table 1 Proximate composition of rice glutelin extracted by four different methods %

由表1可知，仅仅通过碱提酸沉法提取获得的大米蛋白的混合物中蛋白质含量仅为（82.10±0.27）%（样品1），其中还含有一部分没有分离完全的淀粉；碱提法结合分步提取可使得所获样品中蛋白含量增加到90%以上，但重复分步提取步骤（样品2和4）使得产品中灰分含量增加。

2.2 电泳测定结果

用4种不同制备方法获得的蛋白样品的SDS- PAGE结果见图2。标准蛋白与米谷蛋白电泳后, 根据迁移率和标样分子质量对数的工作曲线，估算被测样品亚基的分子质量。结果显示，尽管4种提取工艺在碱提后的处理方法不相同，但对于相同来源的大米原料，主要应用稀碱提取米谷蛋白的情况下，所得到的电泳图谱基本相同，均主要呈现出3条条带：19、33、50 ku，但4种不同提取工艺所得到的电泳条带清晰度有差别。处理米谷蛋白的工艺越精细，清晰度越高，即通过提纯的步骤使得蛋白样品的纯度有所增加。

图2 4种不同工艺获得的米谷蛋白的电泳图Fig.2 SDS-PAGE of rice glutelin extracted by four different methods

通 过对比样品3和样品4的结果还显示，随着碱液应用的次数增加，50 ku的部分含量有所增加，说明提取过程中采用乙醇、碱和酸法二次提取米谷蛋白不仅会加大损失，更会促使其分子间的聚集，从而影响亚基分布。

2.3 SEC-HPLC测定结果

应用4种不同制备方法获得的米谷蛋白样品的分子质量分布见图3。与标准曲线对照发现，所有样品中均包含了分子质量＞106u以及570、194、77 ku的不同聚合程度的米谷蛋白亚基（保留时间分别为6.0、8.5、9.4、10.1 min）。结果表明，繁杂的蛋白质提取工艺会相应地增加其提取物质的纯度，表现在样品2、3和4保留时间在11 min后的部分含量很少，但样品2和样品4由于二次提取中加入碱液及酸量过多，以及盐溶液与乙醇溶液的二次提取导致部分分子变性 聚集，表现在6.0 min（＞106u）左右处的部分含量增加明显。

图3 4种不同工艺获得的米谷蛋白的体积排阻高效液相色谱图Fig.3 SEC-HPLC of rice glutelin extracted by four different methods

2.4 SEM测定结果

冷冻干燥后的样品通过SEM进行表面微观结构分析结果见图4。样品蛋白均呈大颗粒结构，其中，在同样的扫描条件下，样品1仅通过碱提酸沉所提取，蛋白质表面较为平滑。原因为所得蛋白质还含有约10%的大米淀粉等糖类物质，在大米中蛋白质和糖类物质呈胶合状态，蛋白质的网络结构中充满糖类化合物[20]。其他3种蛋白样品的颗粒表面有孔径，原因是糖类物质与蛋白质分离且含量减少，但由于所采用的提取方法并未使得蛋白质水解，其完整结构未受影响。样品3的表面孔径多，呈现出较疏松的结构，可能与其纯度高，从而完全呈现出蛋白质的骨架结构有关。样品2和样品4的表面孔径可能与采用二次提取、多次的酸碱处理使蛋白质部分分子变性聚集有关。

图4 4种不同工艺获得的米谷蛋白的扫描电镜图（×5 000）Fig.4 Scanning electron microscopic pictures of rice glutelin extracted by four different methods (× 5 000)

2.5 DSC测定结果

表2 4种不同工艺获得的米谷蛋白的热力学性质Table 2 Thermodynamic properties of rice glutelin extracted by four different methods

采用DSC测定了4种不同制备方法获得的米谷蛋白样品的热稳定性。DSC检测蛋白质体系在程序控温过程中的热量变化，可提供与蛋白质热变性有关的信息，如蛋白质空间构象的变化、热稳定性、热变性的原因、热变性动力学、热稳定性与生理活性的关系等来表征蛋白分子的热稳定性[21]。从DSC图谱中未发现明显的多峰出现，说明4种方法提取的蛋白质主要成分是米谷蛋白。由表2可知，4种方法所得的蛋白其热处理过程中变性的峰值温度相差不大，但变性热焓的差别比较明显。焓值代表键断裂及放热等累积在一起呈现出来的综合吸热量[22]，也反映了蛋白质结构的有序程度[23]。样品1焓值最低，可能与其成分中包含了较多的非蛋白组分有关；而样品2和4比样品3焓值略低，可能与其分子部分变性有关。

3 结 论

在SDS-PAGE电泳中，不同提取方法获得的米谷蛋白其电泳图谱基本相同，分子质量分布大体一致，但电泳条带清晰度随着加工工艺的精 细不同而有所差别。结合SEC-HPLC测定结果中不同样品的峰面积和峰数可得出：提纯步骤增加会提高所获蛋白的纯度，但过多的酸碱处理会促使蛋白分子部分变性聚集，其中碱提法结分步提取以及水洗工艺能够获得较高纯度的米谷蛋白。通过SEM观察所提取的米谷蛋白可知，样品3的蛋白微观结构具有孔径多、结构疏松、呈现出蛋白质骨架结构的特点。DSC检测结果显示，对于不同方法提取同一种大米中所含的米谷蛋白，所得到的吸热趋势相似，其中样品3的焓值高、热稳定性最好。本研究所获得的纯度较高、结构改变小的米谷蛋白样品有利于后续酶法脱酰胺改性的顺利进行。

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Effects of Extraction Methods on Physico-chemical Properties of Rice Glutelin

LI Na, LI Xiang-hong, LIU Yong-le*, YU Jian, WANG Fa-xiang, WANG Jian-hui
(Department of Food and Biology Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410004, China)

The effects of different extraction methods on physico-chemical properties of rice glutelin were studied. Sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gelelectrophoresis (SDS-PAGE), size exclusion high performance liquid chromatography (SEC-HPLC), scanning electron microscope (SEM) and differential scanning calorimetry (DSC) were used to characterize the properties of extracted proteins. The results showed that the protein content of rice glutelin prepared by alkali extraction combined with sequential extraction and washing process was (93.42±0.32)%. SDS-PAGE analysis revealed three clear bands (19, 33 ku and 50 ku). The molecular weight distribution of the sample showed that there were fewer fractions with small molecules and large molecules larger than 106u. Our microstructural observation demonstrated that the protein backbone structure was exposed after all four different alkali extractions. Meanwhile, the highest enthalpy of the sample showed its good thermal stability.

rice glutelin; extraction; molecular structure

TS213.3

A

1002-6630（2014）03-0043-04

10.7506/spkx1002-6630-201403009

2013-04-17

“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD31B08）；国家自然科学基金青年科学基金项目（31101214；31201427）；湖南省科技重大专项（2010FJ1007）；湖南省自然科学基金项目（13JJ4054；12JJ6028）

李娜（1989—），女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：na182007@163.com

*通信作者：刘永乐（1962—），男，教授，博士，研究方向为食品生物技术与农产品深加工。E-mail：lyle19@163.com