钟俊桢，顿儒艳，黄宗兰，刘 伟，刘成梅*

腰果蛋白的提取工艺条件优化

钟俊桢，顿儒艳，黄宗兰，刘 伟，刘成梅*

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

以腰果为原料，分析腰果仁的主要成分，比较研究不同提取方法对蛋白质提取率的影响；以料液比、提取液pH值、提取温度、提取时间为单因素，运用单因素和正交试验设计，优化腰果蛋白提取的最佳工艺条件。结果表明：腰果仁中粗脂肪含量最高，达44.13%，其他组分含量为：碳水化合物22.91%、蛋白质19.41%、水分3.07%、灰分2.45%；研究发现碱提法提取效果最佳，并确定其最佳工艺条件为料液比1∶40（g/mL）、提取液pH 9、提取温度35 ℃、提取时间1.5 h，此条 件下获得的腰果蛋白提取率可达79.0%，腰果蛋白质的纯度为86.62%。腰果蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明：腰果蛋白主要含有22、26.2 kD的亚基，其次是14.1、16 kD，少量亚基为67.5、88 kD。

腰果；蛋白质；营养成分；提取优化；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶

腰果属多年生热带常绿乔木果树，生于热带亚热带，是世界四大著名坚果之一，具有非常高的营养药用和保健价值[1]。腰果果仁营养丰富，多用于制腰果巧克力、点心和油炸盐渍食品。腰果仁油为上等食用油，副产品有果壳液、果梨等[2]。腰果的果仁约含40%～57%的油和21%蛋白质，蛋白质含量是一般谷类作物的2 倍之多，氨基酸的种类与谷物中氨基酸的种类互补，是一种具有高营养价值的食物[3]。有研究[4]显示浓缩腰果蛋白可作为营养添加剂添加入食品中，增强食物的营养，还可以作为功能性食品，改善人体由于缺少蛋白质而引起的一些疾病等。现代医学研究表明，腰果具有许多重要的医药保健作用，例如抗癌、抗菌等作用。目前，主要研究是关于腰果油和腰果酚的报道[5-8]，对于腰果果仁中蛋白质的利用和开发还少有研究。Prabha等[9]通过腰果球蛋白粕喂养大鼠，对其监测腰果球蛋白饮食对脂质代谢的影响。Ogunwolu等[10]报道了腰果中浓缩蛋白和分离蛋白的功能性质。Bora等[11]比较研究天然腰果蛋白和变性蛋白功能性质的区别。Yuliana等[12]研究pH值和NaCl对腰果壳分离蛋白功能性质的影响。尽管有一些腰果蛋白功能性质的研究报道，但关于提取优化的工艺研究甚少。腰果蛋白的提取工艺的优化为食品加工产业化提供理论指导，为稀有资源的开发与利用提供理论依据，也丰富了食品行业、医药业保健药品的开发利用等。

本实验主要以腰果为原料，分析其主要成分，对腰果蛋白质的提取方法及工艺条件进行研究，以期得到最佳提取工艺，并运用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法对提取的腰果蛋白进行分析，为腰果蛋白加工利用等研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

腰果购于南昌洪城大市场，于0～4 ℃贮藏。

SDS-PAGE凝胶电泳所用试剂 美国Sigma公司；所用试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HR83型快速卤素水分测定仪 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Sx-4-10型马弗炉 湖北英山国营试验设备厂；FreeZone12plus真空冷冻干燥机 美国Labconco公司；KV-9820自动凯氏定氮仪 美国Microfluidics公司；UV-1600PC紫外分光光度计 上海天美科学仪器有限公司；LXJ-IIBB高速离心机 上海安亭科学仪器厂；HH-4数显恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制度有限公司；041BR86999电泳仪 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 原料营养成分的测定

水分含量测定：采用常压干燥法，GB/T 5009.3—2010《食品中水分的测定》；碳水化合物含量测定：采用GB/T 5009.7—2003《食品中还原糖的测定》的方法；粗脂肪含量测定：采用索氏提取法，GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的测定》；蛋白质含量测定：采用凯氏定氮法，GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》；灰分含量测定：采用灼烧法，GB/T 5009.4—2010《食品中灰分的测定》。

1.3.2 蛋白质含量的测定

蛋白质含量测定：采用考马斯亮蓝Bradford法[13]，以牛血清蛋白为标准蛋白，考马斯亮蓝G-250染色，得标准曲线方程为：Y=0.004 6X-0.012 5，R2=0.996 4。按下式计算腰果蛋白提取率。

1.3.3 原料处理及蛋白提取

1.3.3.1 原料预处理

实验前选取颗粒饱满、无病虫害、质地均匀的腰果，取一定量的腰果在粉粹机中进行粉碎，放在干燥器中备用，用石油醚脱脂[14]，得到腰果粉。

1.3.3.2 腰果蛋白提取方法选择

1）Tris-HCl法[15]：取脱脂后的样品1 g，向其中加入50 mL 0.2 mol/L pH 8的Tris-HCl缓冲液，搅拌溶解，并在45 ℃条件下浸提6 h，于4 000 r/min离心15 min，取上清液测定蛋白质含量。

2）盐溶法：取脱脂后的样品1 g，向其中加入50 mL 0.14 mol/L的NaCl溶液，搅拌溶解，并在45 ℃条件下浸提6 h，于4 000 r/min转速下离心15 min，取上清液测定蛋白质含量。

3）碱溶酸沉法[16]：取脱脂后的样品1 g，向其中加入50 mL的蒸馏水，用0.01 mol/L的NaOH溶液调pH值至10，搅拌溶解，并在45 ℃条件下浸提6 h，于4 000 r/min离心15 min，取上清液测定蛋白质含量。

1.3.4 蛋白质提取工艺的确定

1.3.4.1 单因素试验设计

采用碱提法，在其他条件一定时，料液比采用1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）6 个水平，0.01 mol/L的NaOH溶液调节提取液pH值7、8、9、10、11、12共6 个水平，提取温度采用25、30、35、40、45、50 ℃ 6 个水平，提取时间采用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h共5 个水平分别进行单因素试验。

1.3.4.2 正交试验设计

根据单因素试验结果，选择料液比、提取液pH值、提取温度、提取时间进行四因素三水平L9（43）正交试验，试验设计见表1。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.5 SDS-PAGE凝胶电泳[17]

将提取的腰果蛋白配制成1 mg/mL溶液，与样品缓冲液（pH 6.8、0.5 mol/L Tris-HCl 2.0 mL，10 g/100 mL SDS 4.0 mL，甘油2.0 mL，β-巯基乙醇1.0 mL，0.1 g/mL溴酚兰0.5 mL，超纯水0.5 mL）按1∶1的体积比例混合，各8 μL。100 ℃煮沸5 min，离心，上样8 μL，分离胶质量浓度12 mg/100 mL，浓缩胶质量浓度5 mg/100 mL。开始电流8 mA，进入分离胶后16 mA，电泳时间3.5～4 h。至溴酚蓝前沿到达分离胶底部时停止电泳，拨胶，考马斯亮蓝R-250染色液染色1.5～2 h，脱色，至凝胶背景为无色时为止，拍照，分析蛋白质迁移率。

2 结果与分析

2.1 腰果原料基本成分分析

从表2可以看出，腰果仁中含量最高的是粗脂肪，含量44.13%，其次依次为碳水化合物22.91%，蛋白质19.41%，与文献[3]中报道腰果仁中约含40%～57%的油和21%左右的蛋白质基本一致，蛋白质含量可能由于产地和品种的不同存在一定差异。

表2 腰果原料基本成分分析Table 2 Proximate composition of cashew nuts

2.2 提取方法的选择

图1 不同提取方法对腰果蛋白提取率的影响Fig.1 Effect of extraction solvents on protein extraction from cashew nuts

选用不同方法提取腰果蛋白，由图1可以得出，相比于盐溶法和Tris-HCl法，采用碱溶法显著提高蛋白质提取率，达到40.09%（P＜0.05），盐溶法最低20.15%，相比较而言，提取率相差多达约20%。所以本实验采用碱提法。研究显示碱可以使腰果的结构变疏松，打破蛋白质分子间的部分氢键[18]，增加了蛋白的溶解度，使得提取率增加。

2.3 单因素试验

2.3.1 料液比对腰果蛋白质提取率的影响

图2 料液比对腰果蛋白质提取率的影响Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on protein extraction from cashew nuts

选取温度45 ℃、时间1 h、pH 9时，以料液比为变量进行3 次平行试验，由图2可知，料液比从1∶10～1∶40（g/mL）时，蛋白质提取率呈上升趋势。当料液比为1∶40（g/mL）时，提取率显著增高，达到最大为56.32%（P＜0.05）。随着提取液用量的持续增大，提取率逐渐降低至33.05%。可能的原因是随着溶液体积的增大，溶剂增加，原料内外蛋白质浓度差加大，蛋白质越容易渗透到提取液中，提取率相应增大[19]。当提取液用量继续增加时，蛋白质溶解达到饱和，加水量过多，酸沉时上清液中残留的的清蛋白量增加，蛋白的损失量也就增高[20]，提取率反而下降，此外，食品工业生产过程中，提取液用量过大会影响浓缩干燥的加大，增加了产品成本，故选取料液比为1∶40（g/mL）进行提取分析。

2.3.2 pH值对腰果蛋白质提取率的影响

图3 pH值对腰果蛋白质提取率的影响Fig.3 Effect of pH on protein extraction from cashew nuts

选取料液比为1∶40（mg/mL）、温度45 ℃、时间1 h，以pH值为变量进行3 次平行试验，由图3可知，提取液pH值由7升到10时，腰果蛋白质的提取率随着pH值的增高而增大，最高达到53.25%（P＜0.10），但当pH值继续增大时，提取率有下降的的趋势。这是由于碱可以使腰果的结构变疏松，还会打破蛋白质分子间的部分氢键[18]从而促使淀粉和蛋白质分离，增加了蛋白提取率，而当pH值继续增大时，在强碱环境下蛋白质容易变性和水解，同时使蛋白产品的颜色变深，蛋白质长时间受强碱作用会引起“胱赖”反应，还会生成有毒化合物[21]，因此试验的最适提取pH值在9～10之间。

2.3.3 提取温度对腰果蛋白质提取率的影响

图4 提取温度对腰果蛋白质提取率的影响Fig.4 Effect of temperature on protein extraction from cashew nuts

选取料液比为1∶40（mg/mL）、pH 9、时间1 h，以温度为变量进行3 次平行试验，由图4可知，不同提取温度对蛋白质的提取率具有显著影响（P＜0.05）。当提取温度为25～35 ℃，提取率逐渐上升，由56.00%上升到61.07%，随着温度的持续升高，提取率降低至54.73%。原因可能是35 ℃前，随着温度的升高，亲水基团慢慢展开，巯基含量增加，蛋白质的溶解度升高；随着温度的持续升高，疏水基团被暴露和展开，使得蛋白质分子聚集，溶解度下降[22]，导致提取率下降。当温度升高至一定程度时，蛋白质可能发生变性，所以试验提取温度选在35 ℃左右。

2.3.4 提取时间对腰果蛋白质提取率的影响

图5 提取时间对腰果蛋白质提取率的影响Fig.5 Effect of extraction time on protein extraction from cashew nuts

选取料液比为1∶40（mg/mL）、温度45 ℃、pH 9，以浸提时间为变量进行3 次平行试验，由图5可知，在1.5 h之前，腰果蛋白的提取率随着时间的延长而显著提高，由48.27%上升到63.93%（P＜0.05），1.5 h之后，提取率出现下降趋势，下降至55.47%。这是由于去脂腰果粉本身需要一定的溶胀时间，充足的溶胀时间利于蛋白质的分离溶解[23]，若提取时间过长，浸提液中已溶蛋白质达到饱和[24]，并且随着疏水基团的暴露，有部分蛋白质出现凝聚沉淀，导致提取率的降低。

2.4 腰果蛋白质提取条件优化

在单因素试验基础上做正交试验，优化提取工艺。正交试验结果见表3。

表3 腰果蛋白提取条件优化的正交试验结果Table 3 Orthogonal array design with experimental results

表4 正交试验结果方差分析表Table 4 Analysis of variance for protein yield with various extraction conditions

选取料液比（A）、提取液pH值（B）、提取温度（C）、提取时间（D）4 个因素，以腰果蛋白的提取率为指标，得出优化条件。从表3极差R值可以得出，对腰果蛋白提取率影响因素由大到小依次是B＞A＞C＞D，即pH值对腰果蛋白的提取率影响最大。可以得出，最佳工艺条件为A2B3C2D2，即料液比1∶40（g/mL）、提取液pH 9、提取温度35 ℃、提取时间1.5 h。由表4方差分析结果表明：pH值为影响腰果蛋白质提取过程的显著因素，料液比、提取时间、提取温度为不显著因素。根据最佳工艺条件对腰果蛋白进行提取，测得腰果蛋白的提取率可达79.0%，纯度为86.62%。

2.5 腰果蛋白的亚基分布和分子质量

图6 腰果蛋白质电泳图Fig.6 SDS-PAGE of protein from cashew nuts

采用SDS-PAGE凝胶电泳对提取的腰果蛋白进行分析，其亚基分布见图6。染色后提取的腰果蛋白质条带相比于原料清晰可见，染色程度越深，说 明含量越高，纯度越高，反之越低[25]。由图6可知，提取得到的腰果蛋白相比于腰果原料清晰可见，可以得出提取出的腰果蛋白纯度相对较高。从第5列分析，根据迁移率的不同，计算出腰果蛋白中主要含有22、26.2 kD，其次是14.1、16 kD，少量亚基为67.5、88 kD。SDS-PAGE凝胶电泳实验说明了腰果蛋白的多样性，验证了提取的腰果蛋白的纯度较高。

3 结 论

3.1 根据国标法测定了腰果的主要成分如下：粗脂肪含量最高，达44.13%，其他组分含量为：碳水化合物22.91%，蛋白质19.41%，水分3.07%，灰分2.45%。

3.2 选择最优提取方法碱提法，并通过单因素、正交试验得出腰果蛋白提取的最佳工艺条件是：料液比1∶40（g/mL）、提取液pH 9、提取温度35 ℃、提取时间1.5 h，所得腰果蛋白的提取率可达79.0%，纯度达86.62%。

3.3 SDS-PAGE凝胶电泳得出腰果蛋白中主要含有22、26.2 kD，其次是14.1、16 kD，少量亚基为67.5、88 kD，表现了腰果蛋白的多样性和提取后的纯度较高。

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Optimizing the Extraction of Protein from Cashew Nuts

ZHONG Jun-zhen, DUN Ru-yan, HUANG Zong-lan, LIU Wei, LIU Cheng-mei*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

In the present study, cashew nuts were analyzed for main chemical components. A comparative investigation of different extraction methods for protein extraction from cashew nuts was made. The extraction process was optimized with regard to solid-to-liquid (S/L) ratio, solvent pH, extraction temperature and time by single-fact or and orthogonal array designs. The results showed that crude fat was the most abundant component in cashew nuts with a level of 44.13%, which also contained 22.91% carbonhydrates, 19.41% protein, 3.07% water and 2.45%. The best extraction efficiency was achieved using alkali extraction and the best experimental conditions were found to be extraction at 35 ℃ for 1.5 h using an extraction solvent at pH 9 with an S/ L ratio of 1:40 (g/mL). Under the optimized conditions, the yield of protein was 79.0% with a purity of 86.62%. SDS-PAGE analysis showed that the major subunits of cashew nuts protein had a molecular mass of 22 and 26.2 kD, respectively, and 14.1- and 16-kD subunits and a small amount of 67.5- and 88-kD subunits were also observed.

cashew nuts; protein; nutritional components; optimized extraction; sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)

TS255.6

A

1002-6630（2014）16-0018-05

10.7506/spkx1002-6630-201416004

2013-10-24

公益性行业（农业）科研专项（201303077）

钟俊桢（1984—），女，助理研究员，博士，研究方向为食品科学与工程。E-mail：zhongjunzhen@163.com

*通信作者：刘成梅（1963—），男，教授，博士，研究方向为食物资源利用与开发。E-mail：chengmeiliu@yahoo.com.cn