刘宁，张振，任皓威，何扬波，曹宇彤，谭居中，李贺佳

（1.国家乳业工程技术研究中心，黑龙江省乳品工业技术开发中心，哈尔滨 150028；2.东北农业大学食品学院，乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

气相色谱法测定牛乳脂肪酸前处理方法的优化

刘宁1,2，张振1,2，任皓威1,2，何扬波1,2，曹宇彤1,2，谭居中1,2，李贺佳1,2

（1.国家乳业工程技术研究中心，黑龙江省乳品工业技术开发中心，哈尔滨 150028；2.东北农业大学食品学院，乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

优化气相色谱法测定牛乳脂肪酸时甲酯化处理方法的条件。利用氨水-乙醇法提取牛乳中脂肪，通过不同条件下各因素试验和响应面分析，使脂肪酸甲酯化的参数最佳，测定甲酯化前后脂肪酸酸值，计算甲酯化率。经回归分析确定脂肪酸甲酯化的最优条件为：反应时间为23.05 min，反应温度为84.24℃，KOH-甲醇的添加量为2.23 mL，三氟化硼-甲醇添加量为1.13 mL，在此条件下牛乳脂肪酸甲酯化率达到99.2%。比未优化前脂肪酸甲酯化率明显提高，且节省样品和试剂，对牛乳脂肪酸准确定性定量分析具有重要意义。

气相色谱；脂肪酸；甲酯化；响应面

牛乳最主要的脂质成分是甘油三酯，约占脂质97%～98%，由三分子脂肪酸和一分子甘油酯化构成[1]。在脂肪酸分析时一般不直接进行气相色谱分析，因为脂肪酸特别是长链脂肪酸沸点高、在高温下不易挥发、检测时柱温高、脂肪酸难分离，对脂肪酸定性和定量测定均有干扰，因此，在脂肪酸分析时一般都要进行前处理，即脂肪酸衍生化[2]。脂肪酸衍生化方法分为碱催化[3]、酸催化[4]和酶法催化[5]等。脂肪酸甲酯一般通过碱性或者酸性方法衍生化而成，其中碱法催化更适合脂肪酸甘油酯的甲酯化，酸法催化更适合游离脂肪酸甲酯化。气相色谱-氢火焰离子检测器（GCFID）是脂肪酸组成分析最常用的方法[6-7]，通常分析前，脂肪酸需要转换为其衍生物—脂肪酸甲酯，使其变成低沸点易挥发汽化的物质。近年来，国内外研究对不同的脂肪酸衍生化方法多有报道，陈炜等利用碱催化法分析德昌水牛乳脂肪酸组成[8]，Burdge等采用硫酸-甲醇法甲酯化脂肪酸[9]，然后再对脂肪酸进行分析，而在测定牛乳脂肪中脂肪酸时一般常用碱催化即氢氧化钾-甲醇法，该法所用氢氧化钾-甲醇量、酯化温度、酯化时间及BF3-甲醇量都将对衍生化结果产生影响。虽然许多研究都描述了氢氧化钾-甲醇法衍生化脂肪酸，但与现有方法相比较均无相统一的甲酯化条件，并且现有方法与相关文献中甲酯化时间稍短、温度偏高以及试剂添加量大，经预试验后发现并不是牛乳脂肪酸分析时的最佳条件。

为更加合理准确地定量定性分析牛乳脂肪酸，本研究对气相色谱法分析脂肪酸时衍生化方法的甲酯化时间、甲酯化温度、KOH-甲醇加入量和三氟化硼-甲醇加入量对脂肪酸甲酯化率的影响进行考查，应用响应面分析法优化脂肪酸甲酯化法的条件，并据此对牛乳样品中脂肪酸进行甲酯化率测定和比较。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛乳采自黑龙江完达山牧场；三氟化硼由阿法埃莎化学有限公司生产；氨水由固安县清远化工厂生产；无水乙醇、乙醚、石油醚均由天津市天力化学试剂有限公司生产；甲醇由天津市富宇精细化工有限公司生产。

1.2 仪器与设备

分析天平由梅特勒-托利多仪器有限公司生产；离心机由上海安亭科学仪器厂生产；氮吹仪由奥特赛思仪器有限公司生产；漩涡振荡器由上海琪特分析仪器有限公司生产；水浴锅由天津奥特赛斯仪器有限公司生产；抽提瓶由黑龙江省盛达生物试剂有限公司生产；气相色谱7890A由美国安捷伦公司生产。

1.3 牛乳脂肪的提取

称取牛乳样1.0 g，加入0.2 mL氨水，于65℃水浴锅中放置15 min，取出轻摇，冷却至室温。在制备好的样品中加入1 mL无水乙醇，混匀。加入2.0 mL乙醚，加塞振摇1 min。加入2.0 mL石油醚，加塞振摇1 min，静置、分层，有机层转入10 mL螺口玻璃管中。再加入2.0 mL乙醚及2.0 mL石油醚，加塞振摇1 min，静置、分层，有机层转入螺口玻璃管，加1.0 mL乙醚及1.0 mL石油醚重复操作一次。合并抽提液于螺口玻璃管中，氮吹仪吹干，得到牛乳脂肪浓缩物[10]。

1.4 甲酯化率的测定

1.4.1 酸值的测定

酸值测定方法参见文献[11]。

1.4.2 计算甲酯化率

甲酯化率（%）＝（Av1-Av1）/Av1×100%；其中，Av1—样品反应前酸值；Av2—样品酯化一定时间后酸值。

1.5 试验因素选择

往1.3提取的乳脂质中加入氢氧化钾-甲醇溶液（0.5、1、1.5、2、2.5 mL）置于水浴（50、60、70、80、90℃）上回流到油滴消失。再加入三氟化硼-甲醇溶液（0、0.5、1、1.5、2 mL），继续回流（5、10、15、20、25、30 min），冷却至室温，将磨口玻璃管中的液体移入10 mL离心管中，分别用0.3 mL饱和氯化钠溶液清洗磨口玻璃管三次，合并饱和氯化钠溶液于10 mL离心管，加入1 mL正己烷，振摇后，以5 000 r·min-1离心5 min，取上清液作为试液，供气相色谱仪。每个水平重复3次，选出反应温度（A）、时间（B）、KOH-甲醇量（C）和催化剂量（D）为影响甲酯化率的最主要因素。

1.6 试验设计

根据Box-Behnken试验设计原理，结合单因素试验结果，选取反应温度（A）、时间（B）、KOH-甲醇量（C）和催化剂量（D）4个对脂肪酸甲酯化有显著影响的因素，采用四因素三水平的响应面分析方法确定最佳脂肪酸甲酯化条件，试验设计因素与水平见表1。

表1 试验因素水平编码表Table 1 Encode table of factors and levels

1.7 数据分析

各样品均进行3次平行试验，采用Design Ex⁃pert 7.0.0，Origin8.5.1，SPSS17.0等软件对各样品进行统计分析，所有试验数据取平行试验平均值。

2 结果与分析

2.1 不同条件下各因素试验结果分析

2.1.1 酯化时间的选择对甲酯化率的影响

随着时间的延长，酯化率不断提高，当到达20 min后，酯化率趋于平衡，之后略有降低。所以，由图1可知应选择20 min酯化时间，保持最高的甲酯化率。但延长反应时间有可能使牛乳脂肪酸氧化，且耗时耗能。

图1 反应时间对甲酯化率的影响Fig.1 Effect of reaction time on methyl esterification rate

2.1.2 酯化温度的选择对甲酯化率的影响

随着温度的升高，酯化率不断提高，当温度到达80℃后，酯化率趋于平衡达到最大，之后随着温度增加酯化率开始下降，可能是由于温度过高使脂肪酸氧化或异构化。由图2可知，所以，应选择80℃的温度，保持最高的甲酯化率。

2.1.3 KOH-甲醇量的选择对甲酯化率的影响

随着KOH-甲醇量的增加，脂肪酸的酯化率不断增加，当KOH-甲醇量增加到2 mL时，脂肪酸甲酯化率达到最高，再增加KOH-甲醇量，脂肪酸酯化率有所下降。这是因为，添加KOH-甲醇量过多时，部分已生成的脂肪酸甲酯在碱性条件下再次水解。结果如图3所示。

图2 反应温度对甲酯化率的影响Fig.2 Effect of reaction temperature on methyl esterification rate

图3 KOH-甲醇对甲酯化率的影响Fig.3 Effect of KOH-methanol on methyl esterification rate

2.1.4 催化剂量的选择对甲酯化率的影响

结果见图4。

图4 催化剂对甲酯化率的影响Fig.4 Effect of catalyst on methyl esterification rate

由图4可知，在不添加催化剂时，脂肪酸酯化率很低，在催化剂后脂肪酸酯化率迅速增加，催化剂添加量为1 mL时，脂肪酸甲酯化率达到最大，再添加催化剂脂肪酸酯化率不再增加反而有所下降，这是因为催化剂用量过多会发生皂化反应，因此，本试验选用催化剂用量为1 mL。

2.2 脂肪酸甲酯化条件的优化

2.2.1 响应面试验结果分析

在预试验的基础上，以脂肪酸甲酯化率作为响应值，对影响脂肪酸甲酯化的主要条件，反应时间（A）、反应温度（B）、KOH-甲醇量（C）、催化剂量（D）等因素进行优化，根据文献[12-13]进行Box-Behnken的四因素三水平响应面试验设计。响应面试验设计及试验结果见表2。

2.2.2 回归模型及方差分析

利用Design Expert 7.0.0软件，对表2中的数据进行回归分析，得到牛乳脂肪酸甲酯化率的回归模型方程：Y=98.01+2.42A+3.18B+0.83C+0.40D+ 0.73AB+0.47AC+0.027AD-0.19BC-0.14BD-0.45CD-4.67A2-3.92B2-1.67C2-0.48D2。

表2 牛乳脂肪酸甲酯化影响因素响应面试验设计与结果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology for the conditions of fatty acid methyl ester process of bovine milk

对该回归模型进行方差分析，由表3方差分析可知，模型P值<0.0001，说明所选用的二次多项模型极显著，即试验方法可靠；失拟项不显著，且该回归模型R2=0.9688，说明该回归方程与试验拟合良好，自变量与响应值之间线性关系显著，因此可用该回归方程代替试验真实值对对试验结果进行分析；该回归模型的相对标准偏差为1.05%远低于10%，说明该试验具有良好稳定性。

通过比较回归模型各因素的F值大小，可以判断影响牛乳脂肪酸甲酯化率的主要因素依次是B> A>C>D，即反应温度>反应时间>KOH-甲醇量>催化剂量。

表3 牛乳脂肪酸甲酯化影响因素试验方差分析结果Table 3 Results of variance analysis about the conditions of fatty acid methyl ester process for bovine milk

2.2.3 各因素间交互作用分析

为形象描述各因素间交互作用对响应值的影响，图5给出各因素交互作用对酯化率影响的响应面。响应曲面坡度趋于陡峭，表明响应值对试验条件改变非常敏感，相反如果响应曲面坡度相对平缓，说明试验条件改变对响应值的影响较小。a～f直观反映了所建立模型各因素交互作用对甲酯化率的影响。从响应面的最高点和等高线可以看出，所选择范围存在极值，既是响应面的最高点，也是等高线最小椭圆的中心点。

由图5a可知，响应曲面坡度比较陡峭，反应时间和温度对脂肪酸甲酯化率的影响比较大，这与统计分析结果相一致，等高线形状反映出两因素交互作用的强弱，可以看出反应时间和温度两个因素的交互作用显著。由图5b看出，靠近时间一侧比较陡峭，靠近KOH-甲醇的一侧比较平缓，说明时间的主效应大于KOH-甲醇，等高线呈椭圆形表明这两个因素交互作用比较显著。由图5c看出，温度一侧明显比KOH-甲醇一侧陡峭，表明温度的主效应大于KOH-甲醇，从等高线看出两个因素的交互作用显著。由图5 d看出，催化剂用量从小到大过程中，响应曲面一直比较平坦，说明催化剂量对酯化率影响不明显，这与统计分析结果相一致。由图5 e看出，温度一侧较陡，催化剂一侧较平坦，说明温度对酯化率影响较大，而催化剂的影响效果较明显。由图5 f看出，响应曲面靠近KOH-甲醇一侧要比催化剂一侧陡峭，说明KOH-甲醇的主效应大于催化剂。

图5 牛乳脂肪酸甲酯化影响因素两两交互作用的响应Fig.5 Response surface about interaction between any two factors on the conditions of fatty acid methyl ester process of bovine milk

2.3 最优条件的确定及验证

利用Design Expert 7.0.0软件进一步对模型分析，得出牛乳脂肪酸甲酯化的最佳条件为：反应时间为23.05 min，反应温度为84.24℃，KOH-甲醇的添加量为2.23 mL，三氟化硼-甲醇添加量为1.13 mL。在该酯化条件下，脂肪酸的甲酯化率可达到99.20%。考虑实际条件的局限性，采用反应时间为23 min，反应温度为84℃，KOH-甲醇的添加量为2 mL，三氟化硼-甲醇添加量为1 mL，进行验证试验，验证试验结果见表4。

表4 验证牛乳脂肪酸甲酯化最优条件的试验结果Table 4 Verificated experiment of the optimal conditions in fatty acid methyl ester process of bovine milk(%)

由表4可知，验证性试验结果平均值为98.03%，与响应面模型预测值基本接近，预测值与试验实际值相对误差为1.19%，表明所建模型方程可靠。

优化前后的脂肪酸气相色谱见图6、7。由图6、7可知，用优化后的方法处理样品得到的色谱峰比未优化方法色谱峰明显偏多，并且峰高也比未优化前高，表明优化后甲酯化的效果更加明显，更有利于脂肪酸的定性定量分析。

图6 未优化处理的脂肪酸气相色谱Fig.6 Gas chromatogram of fatty acids of untreated

图7 优化处理后的脂肪酸气相色谱Fig.7 Gas chromatogram of fatty acids of optimization of processing

3 讨论

牛乳中脂肪酸大部分以脂质形式存在，用气相色谱分析，转化为挥发性好的化合物。传统方法用硫酸、盐酸等催化脂肪酸甲酯化，需加热到较高温度，反应时间长；碱法甲酯化反应时间短，室温酯化，对高不饱和脂肪酸破坏小，但不能酯化游离脂肪酸；KOH-甲醇法中虽然BF3需现用现配，反应时间短且反应温度适中，不至于破坏不饱和脂肪酸，该法优点是脂肪酸甲酯化完全，并适用于游离脂肪酸的甲酯化。姜伟等研究葵花油中脂肪酸甲酯的制备[2]，咸漠等对菌油中脂肪酸甲酯化方法进行探讨[3]，而对牛乳脂肪酸甲酯化优化研究较少。

响应面分析试验结果显示因素间反应温度和时间、温度和KOH-甲醇量、反应时间和KOH-甲醇量的交互作用对甲酯化率的影响显著。在较低反应温度和较短反应时间下，脂肪酸甲酯化率较低，随着反应时间和反应温度的增加，脂肪酸甲酯化率逐渐升高，当达到最高点时，再增加反应时间和反应温度脂肪酸甲酯化率开始下降；当KOH-甲醇量不变时，随着反应温度的增加脂肪酸甲酯化率逐渐增加随后又开始下降，当温度一定时，随着KOH-甲醇量的添加脂肪酸甲酯化率逐渐增加而后基本保持不变；随着催化剂的逐渐增加，脂肪酸甲酯化率无太大变化，而在逐渐增加温度时添加催化剂可缩短脂肪酸甲酯化时间这与袁高峰等研究[14]相一致；KOH-甲醇量和催化剂量无明显交互作用，相互变化对脂肪酸甲酯化率无显著影响。采用优化的方法对脂肪酸甲酯化处理后，利用气相色谱测定可定性定量分析脂肪酸，且该方法既节省样品试剂又能避免反应时间过长温度太高使脂肪酸异构化。

4 结论

a.在单因素试验的基础上通过响应面试验设计，经回归模型与方差分析得出影响脂肪酸甲酯化因素的大小顺序依次为反应温度、反应时间、KOH-甲醇量、催化剂量。因素间交互作用分析表明温度和时间、温度和KOH-甲醇量、时间和KOH-甲醇量的交互作用对酯化率的影响显著。

b.经Design Expert 7.0软件分析，得出脂肪酸甲酯化的最佳条件为：反应时间为23.05 min，反应温度为84.24℃，KOH-甲醇的添加量为2.23 mL，三氟化硼-甲醇添加量为1.13 mL，在该酯化条件下，酯化率可达99.20%。进行验证试验，得到脂肪酸酯化率为98.03%。该方法可为气相色谱测定牛乳脂肪酸提供最佳的前处理条件。

[1]Fuquay J W,Fox P F,McSweeney P L H.Encyclopedia of dairy sciences[M].2nd Edition.Academic Press,2011:655-657.

[2]姜伟,万梓龙,刘发义.甲醇钾催化共轭化反应合成共轭亚油酸甲酯的研究[J].中国粮油学报,2009(3):89-91.

[3]咸漠,康亦兼,刘延,等.菌油脂肪酸碱法甲酯化的研究[J].吉林大学自然科学学报,2001(1):103-105.

[4]Moltó-Puigmartí C,Castellote A I,López-Sabater M C.Conjugat⁃ed linoleic acid determination in human milk by fast-gas chroma⁃ tography[J].Analytica Chimica Acta,2007,602(1):122-130.

[5]赵静,袁永俊.酶法催化酯交换反应制备脂肪酸甲酯工艺研究[J].粮食与油脂,2009(12):17-20.

[6]Lall R K,Proctor A,Jain V P.A rapid,micro FAME preparation method for vegetable oil fatty acid analysis by gas chromatography [J].Journal of the American Oil Chemists Society,2009,86（4）:309-314.

[7]Seppänen-Laakso T,Laakso I,Hiltunen R.Analysis of fatty acids by gas chromatography,and its relevance to research on health and nutrition[J].Analytica Chimica Acta,2002,465(1):39-62.

[8]陈炜,龚卫华,郑玉才,等.德昌水牛乳脂肪酸组成的气相色谱-质谱分析[J].食品研究与开发,2008,29(1):123-125.

[9]Graham C.Burdge,Paul Wright,Amanda E,et al.A method for separation of phosphatidylcholine,triacylglycerol,non-esterified fatty acids and cholesterol esters from plasma by solid-phase ex⁃traction[J].British Journal of Nutrition,2000,84(5):781-787.

[10]中华人民共和国卫生部.GB 5413.3-2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中脂肪的测定[S].北京:中国标准出版社, 2010.

[11]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 5530-2005动植物油脂酸值和酸度测定[S].北京:中国标准出版社, 2005.

[12]汤磊.响应面法优化白芍中芍药苷的超临界流体提取工艺及过程的数学模拟[D].杭州:浙江大学,2010.

[13]Wani A A,Kaur D,Ahmed I,et al.Extraction optimization of watermelon seed protein using response surface methodology[J]. LWT-Food Science and Technology,2008,41(8):514-1520.

[14]袁高峰,陈小娥.共轭亚麻酸甲酯化方法的比较和优化[J].中国粮油学报,2011,26(10):70-75.

Optimization of pretreatment method for fatty acids in bovine milk by gas chromatography/

LIU Ning1,2,ZHANG Zhen1,2,REN Haowei1,2,HE Yangbo1,2,CAO Yutong1,2, TAN Juzhong1,2,LI Hejia1,2(1.National Dairy Engineering&Technical Research Center,Heilongjiang Dairy Industry Technical Development Center,Harbin 150028,China;2.School of Food Science,Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In an effort to optimize the reaction conditions of methyl ester of fatty acid in bovine milk detected by gas chromatography,milk fatty was extracted by ammonia-ethanol method,single factor experiment and response surface analysis was used to optimize the process of fatty acid methyl.Acid values of fatty acids were determined,and the ratio of fatty acid methyl ester then was calculated.The result of response surface analysis showed that the optimum conditions of fatty acid methyl were:a reaction time of 23.05 min,temperature was 84.24℃,the additive of KOH-methyl alcohol was 2.23 mL,and boron trifluoride-methyl alcohol of 1.13 mL.Using these optimal factor values under experimental conditions, bovine milk fatty acid methyl ester of 99.20%was achieved,fatty acid methyl esterificate rate was increased distinctly after adopted to optimal conditions,samples and reagents were saved,which was significant for accurate qualitative and quantitative analysis of fatty acids.

gas chromatography;fatty acid;methyl esterification;response surface

TS252.4

A

1005-9369（2014）02-0060-08

2012-10-24

“十二五”国家科技支撑计划项目（2011BAD09B03）；东北农业大学博士启动基金（2010RCB75）；食品安全与营养协同中心项目（2012B1203D05）

刘宁（1960-），男，教授，博士，博士生导师，研究方向为营养与乳制品加工技术。E-mail:ningliuneau@gmail.com

时间2014-1-17 16:39:06[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140117.1639.010.html

刘宁,张振,任皓威,等.气相色谱法测定牛乳脂肪酸前处理方法的优化[J].东北农业大学学报,2014,45(2):60-67.

Lu Ning,Zhang Zhen,Ren Haowei,et al.Optimization of pretreatment method for fatty acids in bovine milk by gas chromatography[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(2):60-67.(in Chinese with English abstract)