气相色谱法同时测定重楼解毒酊中5 个成分

2014-01-13田红红柳立伟杨卫灵

中成药 2014年10期

田红红，乙引，柳立伟，杨卫灵，伍庆* ，李兴

(1. 贵州师范大学，贵州贵阳550001;2. 贵阳医学院，贵州贵阳550004)

重楼解毒酊是由重楼、石菖蒲、艾叶、艾片等六味药材组成的苗药，具有清热解毒、散瘀止痛之功效。临床用于治疗肝经火毒所致的带状疱疹，皮肤瘙痒，虫咬皮炎，流行性腮腺炎等症［1］。目前，关于重楼解毒酊质量标准的研究较少［2］，原质控标准仅对该制剂中龙脑进行测定，难以有效反应制剂质量［3］。经GC-MS 鉴定，重楼解毒酊中含有1，8-桉叶素、樟脑、龙脑、β-细辛醚和α-细辛醚等成分。1，8-桉叶素、樟脑、龙脑具有抗菌、杀虫、疏风散热、祛湿解毒的作用，同时对多种药物具有良好的透皮渗透作用［4-10］;β-细辛醚和α-细辛醚具有抗炎、杀菌等作用［11-15］，均与本方主治功能相符，故这5 个成分均为该制剂有效成分。为了更好地体现中药制剂的多靶点、多效应的作用机理并完善其质量标准，本实验利用GC-FID 建立了同时测定1，8-桉叶素、樟脑、龙脑、β-细辛醚、α-细辛醚的方法，该方法准确可靠，为更好地控制重楼解毒酊质量提供了依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 HP-6890 气相色谱仪，氢火焰离子检测器(美国Agilent 公司);AL-204 电子天平(梅特勒-托利多);艾本德手动单道移液枪(量程为20 ～200 μL 和100 ～1 000 μL 各一个)。

1.2 试药 1，8-桉叶素(批号110788-200705)、樟脑(批号110747-200507)、龙脑(批号110881-201107)、α-细辛醚(批号100298-201002)对照品均购自中国食品药品检定研究院，β-细辛醚对照品(自制，纯度≥99.0 %);萘(分析纯，天津市致远化学试剂有限公司);无水乙醇(色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司);样品重楼解毒酊为市售 (45 mL/瓶，贵州圣济堂制药有限公司生产)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 HP-INNOWAX 毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm ×0.25 μm);升温程序为初始温度60 ℃保持5 min，以5 ℃/min 升至120 ℃保持5 min，再以5 ℃/min 升至180 ℃保持10 min，最后以20 ℃/min 升至240 ℃，保持3 min;进样口温度250 ℃，分流进样，分流比为5 ∶1，体积流量1.5 mL/min，进样量1 μL，载气为氮气;FID检测器温度250 ℃。

2.2 内标溶液精密称取萘122.8 mg，置于50 mL量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得2.456 mg/mL 的萘内标溶液。

2.3 对照品溶液制备精密称取1，8-桉叶素、樟脑、龙脑、β-细辛醚、α-细辛醚适量，用无水乙醇溶解制成质量浓度分别为0.073 8、0.240、3.64、0.690、0.126 mg/mL 的对照品贮备液。精密吸取1，8-桉叶素贮备液300 μL 于5 mL 量瓶中，再分别加入樟脑对照贮备液200 μL、龙脑对照贮备液1 000 μL，β-细辛醚对照贮备液800 μL、α-细辛醚对照贮备液200 μL，最后加入200 μL 的内标溶液，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度分别为0.004 43、0.009 60、0.728、0.110、0.005 02 mg/mL的混合对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备精密吸取重楼解毒酊0.50 mL 于5 mL 量瓶内，加0.20 mL 内标溶液，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。取该溶液1 mL 于离心管中离心，取上清液进样。

2.5 阴性样品溶液按重楼解毒酊的组成处方及生产工艺分别制成缺石菖蒲阴性样品以及缺石菖蒲、艾叶和艾片的阴性样品。

2.6 系统适用性试验分别吸取样品溶液、混合对照品溶液、阴性样品溶液1 μL，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱峰，见图1。结果表明:阴性样品溶液在1，8-桉叶素、樟脑、龙脑、β-细辛醚和α-细辛醚色谱主峰位置均无色谱峰出现，阴性样品对5 个有效成分的测定均无干扰。

2.7 线性关系考察依次精密吸取“2.3”项下1，8-桉叶素贮备液100、150、300、450、600 μL于5 个5 mL 量瓶中，再依次加入樟脑贮备液50、100、200、300、400 μL，龙脑贮备液250、500、1 000、1 500、1 700 μL，β-细辛醚贮备液200、400、800、1 200、1 400 μL，α-细辛醚贮备液50、100、200、300、400 μL，最后分别加入200 μL 萘标溶液，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取1 μL 进气相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，回归方程、相关系数和线性范围见表1，结果表明各组分在各自进样范围内线性关系良好。

2.8 精密度试验精密吸取同一混合对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样分析6 次，以1，8-桉叶素、樟脑、龙脑、β-细辛醚和α-细辛脑对萘标峰面积的比值计算RSD (n = 6)值分别为1.2%、0.9%、0.5%、0.8%、0.5%。结果表明，仪器的精密度良好。

图1 对照品(A)、样品(B)、缺石菖蒲阴性样品(C)、缺石菖蒲、艾叶和艾片阴性样品(D)的色谱图Fig.1 GC chromatograms of mixed reference substances(A )，sample (B)，sample without Acori tatarinowii Rhizoma (C)and sample without Acori tatarinowii Rhizoma，Artemisiae argyi Folium and lborneolum (D)

表1 线性关系考察结果Tab.1 Calibration curve and linear range

2.9 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液，室温放置，于0、2、4、8、12、24 h 时间点分别进样分析。记录峰面积，结果按照1，8-桉叶素、樟脑、龙脑、β-细辛醚和α-细辛脑与萘标峰面积之比计算 RSD 值分别为1.4%、1.6%、2.2%、2.5%、3.5%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.10 重复性试验取同一批号(20121103)的重楼解毒酊，按照“2.4”项下方法平行制备6 份供试品溶液。在“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱峰面积。用内标法计算，1，8-桉叶素、樟脑、龙脑、β-细辛醚和α-细辛脑的RSD (n =6)分别为1.6%、1.6%、1.1%、1.5%、1.0%。结果表明该方法的重复性较好。

2.11 加样回收率试验精密吸取已知含有量的重楼解毒酊(批号20121103)共9 份，置5 mL 量瓶中，每份0.25 mL。分别用移液枪准确加入“2.3”项下1，8-桉叶素贮备液0.171、0.214、0.257 mL各3 份、樟脑贮备液0.097、0.121、0.145 mL 各3份、龙脑贮备液0.119、0.149、0.179 mL 各3 份、β-细辛醚0.283、0.354、0.425 mL 各3 份、α-细辛醚0.091、0.113、0.136 mL 各3 份，每一份都加入0.20 mL 萘标，用无水乙醇稀释至刻度，按“2.1”项下色谱条件进样分析，计算平均回收率，结果见表2。

2.12 样品测定取3 批样品，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，每批次平行制备3 份，在“2.1”项色谱条件下测定1，8-桉叶素、樟脑、龙脑、β-细辛醚和α-细辛醚的量，结果见表3。

3 讨论

3.1 有效成分鉴定本实验利用GC-MS 法对重楼解毒酊中可气化有效成分进行鉴定，结果表明，其可气化物质较为复杂，经NIST08 谱库鉴定并结合文献确定了1，8-桉叶素、樟脑、龙脑、β-细辛醚、α-细辛醚为该制剂的主要有效成分。

3.2 前处理方法考察重楼解毒酊中乙醇体积分数在45% ～55% 之间，样品中含有一定量的多糖，本实验前处理采用无水乙醇处理样品，使样品乙醇体积分数提高至90% 以上，可以将多糖沉淀出来，降低了对进样口的污染，提高了结果的精密度。本实验采用HP-INNOWAX 柱作为分析柱，该柱不仅分离效果和峰型均优于其他色谱柱，而且该柱可以允许进水，故供试品溶液无需用无水硫酸钠干燥处理，该前处理方法较为简单，回收率较高。