杨 娜, 刘晓帅, 周 亮, 曾代文

(四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所, 成都 610212)

猕猴微卫星标记的遗传分析

杨 娜, 刘晓帅, 周 亮, 曾代文

(四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所, 成都 610212)

目的 人工繁育猕猴所面临的最大问题是繁殖群体过小所导致的近亲交配, 为了防止近亲交配带来的不利影响，采用微卫星分子标记建立猕猴人工繁殖种群的准确系谱非常重要。方法 本研究采用荧光标记引物PCR和毛细管电泳分型的方法将筛选出的14个微卫星位点应用于64只猕猴人工繁育种群，并通过个体鉴别、亲子鉴定以及群体遗传结构分析的方法对其进行评价。结果 这些位点在猕猴中均属于高度多态位点，其中7个位点的期望杂合度(He)和多态信息含量(PIC)值均在0.8以上，14个位点的累计个体鉴别率(CPI)为1.21×10-18，单亲已知时累积排除率(CPE2)和双亲未知时累积排除率(CPE1)可达0.9999和0.9985。结论 这些位点能够对猕猴种群进行准确的个体鉴别、亲子鉴定和群体遗传学参数计算，是可靠、高效的分子标记，或可应用于猕猴人工饲养种群的遗传学管理。

猕猴; 微卫星; 遗传学控制

遗传学控制在实验动物的管理中起着至关重要的作用，它不仅影响实验数据的可靠性，还直接影响着种群的生存与繁殖能力能否长期延续。目前，我国对大、小鼠的遗传质量标准和检测方法都有明确的规定，但是对非人灵长类实验动物的遗传管理还未做要求。

微卫星DNA是目前普遍使用的分子遗传学标记, 我国已成功将其应用于各类实验动物如, 大、小鼠、家兔、比格犬和小型猪[1～5]的遗传质量检测, 同时国外的研究者采用多个高度多态的人源[6]或猴源[7]微卫星位点对非人灵长类动物实施了有效的遗传学控制, 包括个体识别[8]、血缘系谱的建立[9]以及种群遗传分析[10]。由于国外所使用的猕猴大多来源于印度, 而微卫星的多态性要受到地域的影响, 因此这些位点在我国猕猴中的应用还需要系统的验证。

本文采用PCR扩增和毛细管电泳分型的方法，从文献报道的多态性好、分布广的30个位点中筛选出了14个高度多态的位点，从群体遗传结构和个体遗传背景的角度验证了这些位点在我国猕猴遗传学控制中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料

猕猴(Macaca mulatta)64只(12只为野生驯养猕猴，捕获于四川省凉山彝族自治州木里藏族自治县, 52只为子一代), 其中雄性19只, 雌性45只, 体质量2.5～13 kg, 年龄2～10岁[驯养繁殖许可证: 2004驯繁(21-01)号]。饲养于四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所[SYXK(川)2008-058], 前肢内侧头静脉或小隐静脉采血1.5 ml, EDTA抗凝。

PCR反应试剂(北京康为世纪生物科技有限公司); GeneScanTM500 LIZTM分子量标准(美国Applied Biosystems); 荧光标记引物(生工生物工程上海股份有限公司)。热循环仪和水平电泳仪(美国BIO-RAD);遗传分析仪(3130美国Applied Biosystems)。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA的提取 采用常规苯酚-氯仿抽提法提取新鲜血液中的DNA，-20℃保存备用。

1.2.2 微卫星标记 通过前期的预试, 选取了14个微卫星位点[6～7](表1)进行PCR扩增。PCR反应体系:总体积20 μl，包括2×Taq Mix (含有Taq DNA Polymerase、2× Taq PCR Buffer、3 mmol/L MgCl2和 400 μmol/L dNTP mix) 10 μl、10 μmol/L 的上、下游引物各 0.8 μl、100 ng/μl的 DNA 模板 1 μl、超纯水7.4 μl。PCR反应程序: 预变性95℃ 5 min,变性94℃ 30 s, 退火55～58.5℃ 45 s, 延伸72℃ 45 s,共34个循环，最后72℃延伸7 min。

1.2.3 产物检测 将PCR产物稀释5倍，取2 μl与8 μl Hi-Di TM 甲酰胺和 1 μl内标准片段混合, 95 ℃变性5 min后，经ABI 3130测序仪进行电泳，图像采用Genemap软件分析，并进行人工校对，得到各微卫星位点的基因型。

1.2.4 统计分析 采用POPGENE 1.32软件计算各位点在猕猴人工繁育群中的观察等位基因数(na)、有效等位基因数(ne)、表观杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、群体内近交系数(FIS); 采用Cervus3.0.3 计算多态信息含量(PIC)、双亲未知时排除率(PE1)、单亲已知时排除率(PE2)、累积排除率(CPE)、个体鉴别率(PI)和累积个体鉴别率(CPI), 并进行Hardy-Weinberg平衡(HW)和无效等位基因频率(F(Null))分析。

2 结果

14个微卫星位点在64只猕猴中共检测到 150个等位基因, 平均每个位点有10.7个等位基因; 所有位点的PIC值均大于0.6, 其中7个位点: D15S823、D13S765、D10S611、MML9S1、D03S1768、MML3S4和D09S921的He和PIC值均在0.8以上(表2); 同时群体杂合度(He)的平均值为0.813。

上述多态性最高的7个位点的PE2、PE1和PI也是最高的，其累积排除率CPE2和CPE1可达0.9995和0.9903，CPI为1.29×10-07; 所有14个位点的CPE2和CPE1则为0.9999和0.9985(表3)。

表 1 各位点PCR反应引物序列、退火温度及产物大小Table 1 Description of the primer sequences, PCR product size, and the annealing temperature for each locus

在其余多态性较低的位点中有4个位点:D07S794、D06S501、D01S548和D18S537偏离Hardy-Weinberg平衡(P＜0.05或P＜0.01，表2)。

5个位点:D15S823、D13S765、MML3S4、D11S2002、D05S1457的FIS和F(Null)均为正值(表2)。

3 讨论

应用微卫星标记对灵长类实验动物进行遗传学控制在国外起步较早，但是各个实验室所采用的标记都不完全相同，使得检测结果不具有可比性，为了解决这一问题，Kanthaswamy等[6]从各个实验室使用的大量标记中筛选出了15个高度多态的位点作为猕猴遗传检测控制的一组标准位点，本文所使用的位点主要来源于此。本次研究结果表明这些位点在我国猕猴中均属于高度多态位点(当某微卫星位点PIC＞0.5时，即表明该位点为高度多态位点[11])，这与杂合度分析结果相一致，表明目前本单位所建立的猕猴种群具有丰富的遗传多样性，采用这些亲本组建繁殖单元有利于提高动物长期生存力和繁殖率。我国猕猴有6个亚种[12]，本单位饲养的为川西亚种，与福建亚种相比[13]，在位点D01S548上，两者的He和PIC非常相近(He分别为0.742和0.749，PIC分别为0.697和0.695），在位点D03S1768上后者则略高于前者; 与海南亚种相比[14]，在位点D03S1768、D06S501和D10S611上川西亚种的多态性明显高于海南亚种(等位基因数: D03S1768，前者为14个，后者为7个; D06S501，前者为9个，后者为4个; D10S611，前者为12个，后者为4个）;由于川西亚种和福建亚种均属于大陆型种群其基因交流多，因此基因多态性比较接近，而海南亚种位于比较孤立的岛屿上, 其与陆地基因几乎没有交流，导致它们的多态性远远低于川西亚种和福建亚种。目前，我国灵长类动物养殖研究单位已陆续采用微卫星标记对其进行遗传学检测，但各单位使用的标记差别较大，同时由于我国猕猴亚种较多，使得不同单位的检测结果不具有可比性，不利于灵长类实验动物遗传学控制的发展，因此对我国猕猴各亚种进行大样本、多位点的筛选，建立其各自的标准遗传检测微卫星位点是非常有必要的。

表 2 各位点在猕猴人工繁育群中的群体遗传多样性参数Table 2 Heterozygosity, polymorphic information (PIC), and population genetics parametes for all loci at the captive colonies of rhesus macaques

表 3 各位点的亲缘及个体鉴定参数Table 3 Powers of exclusion and genetic identity for all loci

个体鉴别率(PI)和累积个体鉴别率(CPI), 分别表示任意选取2只猕猴, 它们在一个特定位点和所有位点(本实验中为14个)上具有相同基因型的概率。本实验中14个位点的CPI值为1.21×10-18(表3),也就是说任意选取两只猕猴，它们在所有14个位点上具有相同基因型的概率低于1/8.26×1017，使用这些位点，从理论上可以鉴别出8.26×1017只猕猴中的任意一只，而这个数量已经远远超过了目前作者单位人工饲养猕猴的总量，这一结果与Kanthaswamy的研究结果[6]非常接近。说明本文所筛选出的微卫星位点能够对人工饲养的猕猴进行特异的个体遗传学鉴别。

累积排除率(CPE)是指一个任意选取的猕猴在所有位点上能够被正确排除为一个任意选取的猕猴后代父亲或母亲的概率。本研究应用14个微卫星标记CPE2和CPE1可达99.99%和99.87%，仅使用4个多态性最为丰富的位点CPE2就可以达到99%，而使用7个多态性最为丰富的位点，CPE1也可以达到99%，这显示了所筛选出的位点应用于猕猴亲子鉴定的可靠和高效性。

在本次实验中有4个位点偏离Hardy-Weinberg平衡，5个位点的无效等位基因频率(F(Null))和群体内近交系数(FIS)同时为正值，出现这样的结果一方面可能是实验样本是混合样本(部分猕猴为本所原有而另一部分则于另一猴场引进)，不同地方群体会造成Wahlund效应，另一方面，人工饲养猕猴群不是随机交配，因此会使间接估算法(假定群体处于Hardy-Weinberg平衡状态)高估无效等位基因频率[15]，而无效等位基因的存在会使群体间的遗传分化和遗传距离增大[16～17]，显著增加群体的近交率。虽然目前的结果并不能说明本所的猕猴群存在近交现象，但是人工饲养群的数量有限，如果进行长期繁育，应用微卫星分子标记对种群中的个体进行亲子鉴定建立可靠的遗传谱系，从而进行精细的繁育编配以避免近亲交配就显得尤为重要。

综上所述, 这14个多态性微卫星位点能够对猕猴(川西亚种)进行特异的个体鉴别、有效的亲子鉴定和准确的群体遗传学参数计算, 是猕猴可靠、高效的分子标记, 可以应用于猕猴人工饲养种群的遗传学管理。

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Genetic Analysis of Rhesus Macaques(Macaca mulatta)Using Microsatellite Markers

YANG Na , LIU Xiao-shuai, ZHOU Liang, ZENG Dai-wen
(Institute of Laboratory Animals of Sichuan Academy of Medical Sciences &Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 601212, China)

ObjectiveInbreeding is the big problem in captive colonies of rhesus macaques.To preserve genetic variability, the exact pedigree must established by genetic markers.MethodsFourteen autosomal short tandem repeat (STR) loci with high information content were used to 64 rhesus macaques by fluorescently-labeled primer polymerae chain reaction (PCR) and capillary electrophoresis typing.Then, these loci were evaluated by unique genetic characterization, parentage determination, and estimation of parameters.ResultsSeven of the 14 markers have high gene diversity (He) and polymorphic information content (PIC)(＞0.8), the combined probability of genetic identity (CPI) at all loci is 1.21E-18,and the combined probability of no-parent exclusion (CPE1) or single parent exclusion (CPE2) at all loci can reach 0.9985 and 0.9999 respectively.ConclusionThese markers are reliable and highly informative genetic markers, can provide for powerful parentage determination, unique genetic characterization,and accurate estimation of parameters, which are all useful for genetic management of rhesus macaques.

Rhesus macaques; STR; Genetic management

Q95-33

A

1674-5817(2014)02-0131-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.010

2013-09-06

四川省科技基础条件平台项目(2060503)

杨 娜(1982 -), 女, 硕士, 助理研究员, 研究方向:实验动物遗传控制,

E-mail: jasmineyang111@gmail.com

曾代文, E-mail: zdw.11@163.com