外源甜菜碱处理对干旱胁迫下半夏氮代谢及相关酶活性的影响

2014-01-02张红敏李姣姣黑刚刚曹瑞霞周心渝李琳琳杨卫星吴能表

草业学报 2014年4期

张红敏，李姣姣，黑刚刚，曹瑞霞，周心渝，李琳琳，杨卫星，吴能表

（西南大学生命科学学院三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆400715）

半夏（Pinelliaternata）为天南星科半夏属多年生草本植物，是一种常见的中药材，以块茎入药，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效［1］。半夏根较浅，喜温和湿润气候，半夏受干旱、洪涝、高温和强光等环境因素影响较多，从而影响到半夏的生命活力，致使半夏发生严重的非生理性倒苗，导致半夏的减产和块茎品质的下降，其主要成分总生物碱、腺苷、鸟苷、半夏蛋白、挥发油及无机元素等多种化学成分含量也会受到影响。

甜菜碱属于季铵型水溶性生物碱，是一种生理抗旱（盐）剂，通过生理调节作用减缓由于干旱／盐胁迫对植物造成的伤害，以达到提高植物耐旱（盐）性的目的，对植物维持呼吸作用和光合作用的正常进行也具有重要的生理意义［2］。外源甜菜碱的抗旱生理作用研究也取得了一定进展，目前有研究报道，甜菜碱可以有效地缓解干旱引起的小麦（Triticumaestivum）旗叶的气孔和非气孔限制，提高气孔导度和羧化效率［3］；减缓胁迫对植物体内1，5－二磷酸核酮糖羧化／加氧酶（Rubisco）活性的影响［4］。对烟草（Nicotianatabacum）品种大黄金5210（抗旱性强）和中烟100（抗旱性弱）进行根施甜菜碱，发现外源甜菜碱处理减轻了水分胁迫对叶绿素含量、PSⅡ光化学效率、希尔反应活力以及类囊体膜ATPase活性降低程度［5］。

目前的研究主要集中在甜菜碱对逆境胁迫下植物的渗透调节及相关生理特性的影响上，而对其次生代谢产物及氮代谢过程的影响却鲜有报道。本研究以野生半夏为材料，通过喷洒不同浓度的甜菜碱溶液来研究干旱胁迫下半夏体内氮代谢过程中关键酶活性及总生物碱、鸟苷和腺苷等的药用成分的影响，以期探讨提高半夏抵御干旱胁迫下次生代谢的调节机制，并为甜菜碱能有效提高干旱胁迫下半夏有效成分及缓解干旱胁迫伤害提供理论参考。

1 材料与方法

1．1 植物的栽培与处理

半夏块茎购于重庆市北碚区明家沟，经西南大学生命科学学院吴能表教授鉴定为天南星科植物半夏块茎，2012年6月种于西南大学生命科学学院苗圃中。

2012年7月待半夏长成至12cm高左右时，选取长势一致、叶型相同的半夏移栽于盛有充分混匀的介质（壤土∶珍珠岩＝3∶1）的黑色营养袋（25cm×20cm）中，每盆10棵，恢复生长后对其进行干旱处理，干旱通过自然干旱和称重法来进行控制，干旱程度通过土壤相对含水量（土壤相对含水量＝土壤含水量／土壤饱和含水量×100%）来确定，CK为对照组，土壤含水量保持在75%±2%左右，D组为重度干旱，土壤含水量为35%±2%左右，D20组为喷施了20mmol／L的甜菜碱溶液的干旱组，D40组为喷施了40mmol／L的甜菜碱溶液的干旱组，每个处理设置3次重复。在干旱处理的第0，9，18，27天上午10时左右采样，每个处理组随机采样10株，3次重复，进行各项指标测定。

1．2 测定方法

1．2．1 谷氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶及谷氨酸脱氢酶活性的测定谷氨酸合成酶（GOGAT，glutamate synthase）活性的测定参照赵全志等［6］的方法，略有改动，精密称取0．3g半夏叶片剪碎后放于研钵中加2mL 50 mmol／L的pH 8．0的 Tris－HCl缓冲液［含2mmol／L MgSO4、0．5mmol／L EDTA（乙二胺四乙酸，ethylene diamine tetraacetic acid）、10mmol／Lβ－巯基乙醇］冰浴研磨后放入离心管中，4℃下10000r／min离心30min，上清液即为酶提取液。酶活力用μmol NADH／（g FW·min）为单位。

谷氨酰胺合成酶（GS，glutamine synthetase）活性测定参照汤章城［7］的方法。

谷氨酸脱氢酶（GDH，glutamic dehydrogenation enzyme）的活性测定参照 Majerowicz等［8］的方法，略有改动，改动处同GOGAT的酶提取液方法。

1．2．2 硝态氮、蛋白质的测定硝态氮、可溶性蛋白质含量的测定参照李合生［9］的方法。

1．2．3 总生物碱含量的测定称取半夏块茎于60℃下烘干磨碎后过60目筛，其粉末用于总生物碱测定，测定方法参照于超等［10］的紫外分光光度计法。总生物碱含量用mg／g为单位。

1．2．4 鸟苷和腺苷的测定色谱条件：参照张敏等［11］的方法略有改动，Xtimate C18色谱柱（4．60mm×250 mm，5μm），甲醇∶水＝15∶85为流动相，流速为1．0mL／min，检测波长为254nm，柱温30℃，进样量20μL。

样品制备：取半夏块茎于60℃烘干至恒重，研碎后过60目筛，取各处理组样品粉末0．3g加入30%甲醇3 mL后称重，超声提取30min，再用30%甲醇补足重量后于5000r／min离心10min，提取上清液后过0．22μm微孔滤膜后备用。鸟苷和腺苷含量用μg／g为单位。鸟苷、腺苷标准品及样品色谱图见图1。

图1 半夏混合标准品色谱图和样品色谱图Fig．1 P．ternatachromatogram of mixed standard and sample chromatograms

图2 甜菜碱对干旱胁迫下半夏叶片内谷氨酸合成酶活性的影响Fig．2 Effects of different concentrations of betaine treatments on GOGAT activity of P．ternatain drought stress

1．3 数据处理

所有指标均重复测定3次，数据采用SPSS 11．5进行统计分析和方差检验，结果以平均值±标准误差表示。

2 结果与分析

2．1 甜菜碱处理对干旱胁迫下半夏氮代谢相关酶活性的影响

2．1．1 甜菜碱处理对干旱胁迫下半夏叶片中GOGAT活性的影响 GOGAT是氮素同化过程中的关键酶，GS／GOGAT偶联形成的是高等植物氨同化的主要途径，在无机氮转化为有机氮的过程中起关键作用［12－13］。由图2可知，随着处理时间延长，D40、D20和D组的GOGAT活性呈明显下降趋势，而CK组则下降不明显。在处理第9天，CK组与其他3组之间差异达显著水平，D20、D40之间差异不显著，两组分别比D组活性提高了15．6%和14．0%。处理第18天，各组之间差异显著，CK组显著高于其他3组，D20、D40与D组相比活性分别提高14．6%和28．3%。在处理第27天，D20、D组之间差异不显著，D40与D组相比活性提高36．0%。由此可知，干旱对GOGAT活性有明显影响，但喷施外源甜菜碱溶液能缓解酶活性的降低，处理组活性明显高于干旱组，同时也加快了氮素的同化。

2．1．2 甜菜碱处理对干旱胁迫下半夏叶片中GS活性的影响谷氨酰胺合成酶（GS）是催化谷氨酰胺与α－酮戊二酸形成谷氨酸的酶，NH4＋－N的同化主要通过谷氨酰胺合成酶（GS）／谷氨酸合成酶（GOGAT）循环途径，所以GS的活性大小直接影响铵的代谢速度［14］。

随着干旱胁迫时间的增加，各组的GS活性呈下降趋势，CK组下降较缓慢，其活性均大于其他3组。在处理的第9天，D20、D40与D组相比，活性分别提高了11．1%和5．1%，各组之间差异达显著水平。在处理的第18天，D20、D40与D组相比，活性分别提高了7．8%和12．3%。在处理的第27天，D20、D40较D组活性分别提高了9．6%和17．8%，各组之间具有显著性差异（图3）。由此可知，GS活性表现为D40＞D20＞D，较高的GS活性加快了铵代谢，从而有利于积累次生代谢产物。

2．1．3 甜菜碱处理对干旱胁迫下半夏叶片中GDH活性的影响 GDH在NH4＋的合成及Glu的代谢中具有十分独特的作用。它在NH4＋的合成和再合成中起初始性作用，并在Glu合成循环中起补充作用，但是它在高等植物中的生理作用仍有争议［15］。由图4可知，D、D20和D40这3组在干旱胁迫条件下GDH活性呈现先升高后降低的趋势，并在第9天达到最大值。CK组第9天升高，第18～27天期间变化不明显。在处理的第9天，D20活性最高，与CK、D、D40相比，GDH活性分别提高了24．9%，49．4%和11．7%，各组之间差异显著。在处理的第18天，CK组活性值大于处理组，CK组与D20之间差异不显著，D20、D40与D组相比，GDH活性分别提高了20．7%和15．8%。在处理的第27天，CK组活性仍然为最大，与其他3组之间存在显著性差异，D20、D40较D组分别提高了15．6%和25．1%，D40略高于D208．2%，两者差异不显著。由此可知，在处理第9天喷施了20mmol／L的甜菜碱溶液的处理组GDH活性比D、D40高，而在后期，D20与D40组的活性差异不显著。

2．2 甜菜碱处理对干旱胁迫下半夏中可溶性蛋白及硝态氮含量的影响

植物吸收的氮源经一系列的还原与同化过程后形成游离氨基酸、可溶性蛋白等有机含氮化合物，供植物吸收与利用［16］，在干旱胁迫的后期，可溶性蛋白作为一种调节物质，参与了维持细胞较低的渗透势，抵抗干旱胁迫所导致的细胞损伤。由表1可知，干旱胁迫下，随着时间增加，各个组可溶性蛋白含量呈先升高后降低的趋势，CK组后期可溶性蛋白质含量降低较缓慢。CK、D40和D20均在第9天达到最大值，D组在第18天达到最大值。喷施了甜菜碱溶液的处理组蛋白质含量均高于没有喷施的干旱处理组。其中，在处理第9天，D40和D20比D组分别提高了9．5%和6．0%，与D组差异达显著水平，D40与CK组之间差异不显著，与D20之间具有显著性差异。在处理的第18，27天，D40与D组相比分别提高了0．7%和7．3%，另外又比D20提高了6．8%和3．1%。由此可知，40 mmol／L的甜菜碱溶液提高了干旱胁迫下半夏的可溶性蛋白含量，可溶性蛋白参与调解渗透势，用以抵抗干旱胁迫，提高了其抗逆性，降低了逆境对半夏的伤害。

图3 甜菜碱对干旱胁迫下半夏叶片内谷氨酰胺合成酶活性的影响Fig．3 Effects of different concentrations of betaine treatments on GS activity of P．ternatain drought stress

图4 甜菜碱对干旱胁迫下半夏叶片内谷氨酸脱氢酶活性的影响Fig．4 Effects of different concentrations of betaine treatments on GDH activity of P．ternatain drought stress

表1 不同浓度甜菜碱处理对半夏蛋白质含量的影响Table 1 Effects of different concentrations of betaine treatment on protein content of P．ternata μg／g

干旱胁迫影响植物对氮的吸收和利用，造成植物体细胞内氮素代谢的紊乱，GS活性的降低造成了硝态氮积累，20mmol／L的甜菜碱溶液降低了半夏体内的硝态氮含量，提高了对氮素的利用。由表2可知，随着时间的增加，在处理期间各组硝态氮含量呈上升趋势，且D组含量均高于其他3个组，具有显著性差异。在处理的第9天，D组含量分别高于CK组、D20和D4022．4%，8．1%和11．1%，D组与D20差异不显著。在处理第18天，D20和D40差异不显著，在处理第27天，D组含量分别高于其他3个组21．8%，10．2%和5．2%，各组之间具有显著性差异。由此可知，干旱刺激了植物体内硝态氮的产生。

2．3 甜菜碱处理对干旱胁迫下半夏块茎中生物碱的影响

由表3可知，CK、D、D20、D40四个组总生物碱含量都随处理时间延长呈上升趋势，D、D20、D40三个组在处理期间的总生物碱含量均低于CK组。其中，在整个处理期间D组与CK、D20、D40具有显著性差异，增长率远远低于其他组。在处理第9，18，27天时，D40与D组相比，总生物碱含量分别提高了34．2%，48．8%和23．7%，D20较D组总生物碱含量分别提高了26．3%，34．9%和10．2%，在第9天时，D40与CK组之间的差异不显著，在第18天时，D40、D20与CK组具有显著差异。在第27天时，D40与CK组差异不显著。随着干旱时间的延长，40mmol／L的甜菜碱溶液显著提高了干旱胁迫下半夏总生物碱的含量，D、D20、D40的含量高低与GS、GOGAT活性变化趋势相一致，说明这两种酶的活性可能影响了总生物碱的合成。

2．4 甜菜碱处理对干旱胁迫下半夏块茎中鸟苷及腺苷含量的影响

由表4可知，各组的鸟苷含量总体都呈上升趋势，D、D20、D40三个组在处理期间的鸟苷含量均低于CK组，D组与其他3组之间具有显著性差异。在处理的第9天，D20、D40与D相比，分别提高了33．6%和15．3%。在处理的第18天，D20、D40较D组相比，分别提高了43．5%和74．3%，具有显著性差异。在处理的第27天，D20、D40较D组相比，分别提高了50．9%和87．6%，具有显著性差异。

表2 不同浓度甜菜碱处理对半夏硝态氮含量的影响Table 2 Effects of different concentrations of betaine treatment on nitrate content of P．ternata μg／g

表3 不同浓度甜菜碱处理对半夏总生物碱含量的影响Table 3 Effects of different concentrations of betaine treatment on total alkaloid content of P．ternata mg／g

表4 不同浓度甜菜碱处理对半夏鸟苷及腺苷含量的影响Table 4 Effects of different concentrations of betaine treatment on guanosine and adenosine content of P．ternata μg／g

由表4可知，随着时间的增加，各组的腺苷含量总体呈先上升后降低的趋势，除D40在第27天达到最大值外，其余组均在第18天左右达到最大值，CK组含量均大于其他组。在第9天时，D20、D40与D组相比分别提高了13．0%和21．8%，两组与CK组之间差异不显著。在第18天时，D20、D40与D组相比，分别提高了67．2%和46．0%，D20与CK组之间差异不显著，与D40之间差异达显著水平。在第27天时，D20、D40与D组相比，分别提高了43．2%和56．3%，D40与CK组之间差异不显著。由此可知，喷施了外源甜菜碱能促进干旱胁迫下半夏鸟苷和腺苷的积累，其中，鸟苷和腺苷含量均表现为D40＞D。

3 讨论

干旱是植物生存环境中的主要逆境因子之一，主要影响植物各项生理指标的变化及体内有机物的积累，从而致使植物停止生长和发育，最终植物个体或群体生长受抑制，形态发生变化，生物量或产量受到影响［17－19］。水分胁迫也严重制约着半夏的生长发育［20］，易导致半夏的非生理性倒苗，对半夏中的药用成分的积累也产生了一定影响。有研究报道指出，甜菜碱在调节植物对环境胁迫的适应性，提高植物对各种胁迫因子抗性等方面具有重要的生理作用［21］，如水分胁迫下，外源甜菜碱能明显减缓柑橘（Citrusreticulata）干物质的流失，提高柑橘的抗旱性［22］，喷施0．5mmol／L的甜菜碱溶液能缓解玉米（Zeamays）幼苗的水分胁迫，提高幼苗的生物量、叶片相对含水量、根冠比及渗透调节物质、抗氧化酶活性、ABA含量［23］，叶面喷施甜菜碱增强了桃树（Prunuspersica）的抗旱性，减缓了水分胁迫对树体的伤害［24］。

在干旱胁迫下，喷施了外源甜菜碱的处理组总生物碱、鸟苷和腺苷含量均高于没有喷施甜菜碱的干旱处理组，这可能与外源甜菜碱提高了氮代谢过程中关键酶的活性有关。随着干旱胁迫时间的增加，GS、GOGAT活性逐渐降低，植物中氮素吸收主要依靠GS／GOGAT循环，因此氮素的同化受到影响，而这一循环产生的谷氨酰胺和谷氨酸是植物体内合成氨基酸、核酸、多胺和叶绿素等含氮有机物的前体物质［25］。由GS／GOGAT循环产生的谷氨酰胺与天冬氨酸和其他物质结合形成次黄嘌呤，并进一步合成鸟苷及腺苷，因此GS和GOGAT活性的升高能有效增加鸟苷和腺苷的前体物的积累。谷氨酸脱氢酶（GDH）在氨的再同化中起重要作用［26］，它主要是催化谷氨酸＋NADP→α－酮戊二酸＋NADPH＋NH4＋。据推测GDH可能作为GS在不利情况下活性降低的一种补偿，催化谷氨酸脱氨产生的2－酮戊二酸向三羧酸循环提供碳骨架，以稳定生物大分子结构［27］。另外GS、GOGAT活性的降低使NH4＋同化受阻，造成叶片中NH4＋的累积［28］，致使在后期生长中GDH活性降低，硝态氮含量升高，严重影响了半夏对氮素的利用，而喷施了甜菜碱溶液的两处理组硝态氮含量上升幅度均小于未喷施的干旱组，减轻了因NH4＋积累而造成的光合速率下降，提高半夏的抗旱性，降低硝态氮含量，加快氮素的同化。本实验表明，40mmol／L的外源甜菜碱溶液能较好的减缓GS、GOGAT活性的降低，提高GDH活性，清除NH4＋的积累，加速氮素的同化，提高氮代谢水平，为生物碱、鸟苷、腺苷的合成提供更多的前体物质，从而有利于次生代谢产物的积累。

氮代谢状况与植物抗旱性强弱也存在一定的联系，高水平的氮素代谢也可以提高植物的抗旱性。植物体内的可溶性蛋白含量是反映植物体总代谢水平的一个重要指标，半夏叶片中可溶性蛋白含量随着干旱的时间呈现先升高后降低的趋势，在干旱胁迫初期，可溶性蛋白含量增加，它作为一种渗透调节物质，参与维持调节细胞的渗透压，起到了抵御干旱胁迫的作用。在干旱胁迫后期，蛋白酶等一系列水解酶活性增加，促进了蛋白质分解，因此含量开始减少。喷施了甜菜碱溶液的两处理组可溶性蛋白含量均高于未喷施的干旱组，所以较D组而言，喷施了甜菜碱的两干旱处理组抗逆性都有所增强，并且其倒苗时间均晚于D组。

综上所述，氮代谢失调是半夏受到干旱胁迫的重要表现之一，对干旱胁迫下的半夏喷施40mmol／L的外源甜菜碱溶液，能有效提高氮素同化过程中的关键酶（GS、GOGAT、GDH）活性，通过增加前提物质含量从而促进总生物碱、鸟苷、腺苷含量的积累，提高了半夏块茎中的有效成分含量。同时外源甜菜碱有利于提高植物叶片水势、膨压和相对含水量［29］，另外渗透调节物质（可溶性蛋白质）含量的增加，不但提高了叶片渗透调节能力而且在植物体合成有机物的碳源和氮源等方面也发挥了重要作用［30］，因此叶面喷施甜菜碱有助于提高半夏抗旱性，延缓半夏的非生理性倒苗期，为实际生产中缓解半夏干旱胁迫及有效成分的积累提供理论依据。

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