刘铁成

(1.哈药集团技术中心 黑龙江哈尔滨 150012;2.哈药集团生物工程有限公司 黑龙江哈尔滨 150012;3.东北林业大学 黑龙江哈尔滨 150040)

抗EGFR单克隆抗体是一种糖基化、共价交联的四聚体，由两条重链、两条轻链组成。全抗体分子量为145.38kD，等电点为7.8-8.3，消光系数1.40。这样的大分子物质，在生物分泌的过程中要经过很复杂的空间折叠和糖基化修饰，这样不同方法构建的细胞在分泌的过程中难免会有电荷方面的差异，研究找到一种方法能够体现出这种差异，经过研究发现离子交换色谱法可以满足这样的实验要求了。通常这种差异体现在抗体的异质性方面。在其异质性研究过程中发现，随着破坏试验条件的改变，不同的抗体存在着各自的差别，这样的发现对高级结构修饰差异引起的抗EGFR单克隆抗体的鉴定都有重大意义。根据高效液相色谱法分析，各峰之间的异同，可以很好的鉴别产品的特点和优势。

1 材料与设备

色谱柱：CM-STAT，4.6*100mm，TSKgel；色谱系统：安捷伦1260，自动进样器，紫外检测器，4原梯度泵；磷酸二氢钠；磷酸氢二钠；氯化钠；抗EGFR单克隆抗体供试品(哈药集团技术中心提供)；爱必妥(ImClone公司)。

2 实验方法

表1 破坏性试验结果

样品处理：将抗EGFR单克隆抗体供试品用5ml注射用水复溶后，用流动相A稀释10倍，即1mg/ml。爱必妥用流动相A稀释到1mg/ml。

流动相配制 流动相A：10mmol/L磷酸盐缓冲液。称二水磷酸二氢钠1.37g，十二水磷酸氢二钠0.44g，加水至0.9L，用盐酸或氢氧化钠调pH到6.0,定容到1L。流动相B：10mmol/L磷酸盐缓冲液，200mmol/L氯化钠。称二水磷酸二氢钠1.37g，十二水磷酸氢二钠0.44g，氯化钠11.688g，加水至0.9L，用盐酸或氢氧化钠调pH到6.0,定容到1L。流动相用0.45μm水溶性膜过滤，超声脱气15分钟即可。

色谱条件：流速0.5ml/min；柱温25℃；检测紫外检测波长214nm；上样量5ul；记录时间：20min。

3 实验结果

比较分析爱必妥和抗EGFR单克隆抗体供试品在破坏条件下离子色谱变化差异(表1)

4 结果讨论

从蓝色峰图可以看到，爱必妥和抗EGFR单克隆抗体供试品主峰区各峰比例存在一定的差异，且主峰区前面的酸性区(保留时间0～6min)峰数量有差异(爱必妥有一个峰，抗EGFR单克隆抗体供试品有两个峰)。这是由于两种制剂的糖含量以及糖型的种类存在差异，这样就导致蛋白酸碱性的差异，从而使主峰区内各峰的含量存在差异，最终产生峰型的差异。酸性区的峰存在差异，爱必妥和抗EGFR单克隆抗体供试品的酸性区均有峰1，2(保留时间0～2min)，且爱必妥较抗EGFR单克隆抗体供试品的峰1，2含量高；仅抗EGFR单克隆抗体供试品有峰3(保留时间2～4min)，从破坏性试验结果可知，经氧化破坏后，爱必妥也会产生峰3，且抗EGFR单克隆抗体的峰3含量会增加。

通过以上分析和讨论，说明不同抗EGFR抗体产品在离子交换色谱发检测中，存在着差异，这样就对不同厂家生产的抗EGFR抗体有着鉴别的作用。

[1]Vlasak,Ion escu R.Heterogeneity of Monoclonal Antibodies Rebealed by Charge-Sensitive Methods[J].Corr.Oharm.Biotechnol,2008,9(6):468-481.

[2]裴朝玉,杨丽霞.抗EGFR单克隆抗体药物纯度分析.周口师范学院学报,第30卷第2期2013年3月.