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(青岛大学医学院附属医院,山东 青岛266003 1 肿瘤科； 2 中心实验室)

食管癌是世界常见的恶性肿瘤之一，全球每年约有30万人死于食管癌，位居肿瘤死因第6位。目前，对食管癌的治疗，早期以根治性手术为主，对食管癌尤其晚期病人化疗仍占有非常重要的地位，但总有效率并不乐观。因此，寻找对食管癌更有效的药物和治疗方法具有重要意义。目前认为紫杉醇(Paclitaxe)是治疗食管癌最有效的药物之一，单药缓解率(RR)为32%[1]，是临床上一线治疗食管癌的药物，但因毒副作用严重，其应用及疗效受到了限制。大量实验证实，绿茶提取物茶多酚(TP)可通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用[2-3],但TP对食管癌体外作用的报道少见。本研究以不同浓度的TP、Paclitaxel对食管癌Eca-109细胞分别进行单独及联合用药，检测TP、Paclitaxel对肿瘤细胞生长、细胞凋亡及凋亡相关调节基因Caspase-3表达的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂及来源

Paclitaxel(相对分子质量853.92)，哈药集团生物工程有限公司生产； TP(含量98%)，西安奥泽生物科技有限公司生产，用高纯水配成浓度5 g/L溶液，直径0.22 μm的滤器过滤，置于-20 ℃冰箱，避光保存备用；RPMI-1640培养液与胎牛血清，均为Hycloneg公司产品；溴化噻唑蓝四唑(MTT)，Sigma公司产品；AnnxineV/PI凋亡检测试剂盒，购自碧云天生物技术研究所；Caspase-3引物[4](上游引物：5′-TGGAACAAATGGACCTGTTGACC-3′，下游引物：5′-AGGACTCAAATTCTGTTGCCACC-3′)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，预扩增片段为365 bp；逆转录PCR试剂盒购自宝生物工程有限公司。内参照基因为GAPDH，上游引物: 5′-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3′, 下游引物：5′-TGAAGTCAGAGGAGACCACC-3′，预扩增片段为135 bp。

1.2 细胞培养

食管癌Eca-109细胞购于中国科学院上海细胞库，用含体积分数0.10胎牛血清的RPMI-1640培养液(内含100 kU/L青霉素和100 kU/L链霉素)培养，置于37 ℃、体积分数0.05 CO2、饱和湿度的培养箱中，当细胞融合至80%～90%时，进行细胞传代。

1.3 细胞增殖抑制的检测

采用MTT法。收集处于对数生长期的Eca-109细胞，以1×107/L的密度接种于96孔板中，每孔100 μL，置培养箱中培养,等待细胞完全贴壁。将处于对数期的细胞随机分为TP组、Paclitaxel组、两药联合组，分别加入100 μL含不同浓度TP(125、250、500、1 000 mg/L)、Paclitaxel(0.2、1.0、5.0、25.0 mg/L)及TP+Paclitaxe(500 mg/L TP+1 mg/L Paclitaxel)的培养液，并设立阴性对照组、空白对照组，每组5个副孔。置于培养箱中避光培养12、24、48 h后，每孔加150 μL MTT，避光培养4 h，将孔内液体吸出，再向每孔内加20 μL的二甲基亚砜，震荡10 min，在酶标仪上测定490 nm处的吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率(IR)。IR=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。

1.4 细胞形态观察

收集对数生长期细胞，接种于6孔板，每孔2 mL、细胞数40×104，置于培养箱内培养，等待细胞贴壁。将处于对数生长期的细胞随机分为TP组(500 mg/L)、Paclitaxel组(1 mg/L)、 两药联合组(TP 500 mg/L+1 mg/L Paclitaxel)组，对照组不加药物，24 h后，显微镜下观察各组细胞的形态学变化。

1.5 细胞凋亡周期与细胞凋亡率检测

1.5.1细胞凋亡周期的检测 采用PI单染法。细胞处理及实验分组同1.4，每组设3个副孔。收集细胞至离心管，1 000 r/min离心5 min沉淀细胞，去上清。加入1 mL预冷体积分数0.70的乙醇，混匀，4 ℃固定24 h。离心，去上清，PBS洗涤。每管内加入PI 25 μL、RNaseA 10 μL，缓慢并充分重悬，400目筛网过滤，37 ℃避光温浴30 min,流式细胞仪(美国B.D公司)检测细胞周期的分布。

1.5.2细胞凋亡率的检测 采用AnnxineV/PI双染法。细胞处理及实验分组同1.4，每组设3个副孔。收集细胞，1 000 r/min离心5 min沉淀细胞，去上清，冷PBS洗涤。再离心，去上清，重悬细胞于100 μL 1×buffer中。加入AnnexinV 5 μL +PI1 μL，室温下培育15 min。加入400 μL 1×buffer，充分重悬细胞，400目筛网过滤，用流式细胞仪(美国B.D公司)检测细胞凋亡率。

1.6 Caspase-3 mRNA检测

采用半定量逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法。细胞处理及实验分组同1.4，药物作用24 h后，收集细胞，加入TRIzol、氯仿、异丙醇、冰预冷体积分数0.75的乙醇提取细胞总RNA。取总RNA5 μL，在PCR仪上行逆转录反应。反应条件：65 ℃ 5 min、4 ℃ 5 min变性，退火反应，45 ℃ 20 min，95 ℃ 5 min。取逆转录产物1 μL，引物0.4 μL，总反应液10 μL，在PCR仪上行逆转录反应：95 ℃5 min变性，60 ℃ 30 s退火，72 ℃延伸1 min，30个循环。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳,以内参基因GAPDH作对照，应用图像分析系统半定量分析Caspase-3 mRNA的表达。

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 TP和Paclitaxel对Eca-109细胞IR的影响

随着TP、Paclitaxel浓度升高和作用时间延长，细胞IR增加，差异有显著性(F=134.46～423.75，P<0.05)。两药联合组作用12、24、48 h，对细胞的IR分别明显高于TP组、Paclitaxel组(q=8.63～26.96，P<0.05)。采用相互作用指数[5](CDI)评价两药的相互作用(CDI=AB/(A×B)，其中A、B是两药单独作用吸光度值与对照组吸光度值的比值，AB为两药联合组吸光度值与对照组吸光度值比值。CDI>1时，两药相互作用为拮抗作用；CDI=1，两药作用性质为相加；CDI<1时，两药相互作用为协同)。结果显示，作用12、24、48 h，CDI值分别为0.91、0.89、0.85，两药有协同作用(图3)。

2.2 TP和Paclitaxel对Eca-109细胞形态的影响

光镜下，TP组、Paclitaxel组、两药联合组细胞稀疏，形态变圆，细胞皱缩，染色质致密，细胞核固缩，胞质内有凋亡小体产生，两药联合组表现更为明显(图4)。对照组细胞密集，贴壁生长，分裂旺盛，形态规则，呈铺路石样改变，细胞核位于细胞中部(图5)。

2.3 TP和Paclitaxel对Eca-109细胞周期及凋亡率的影响

2.3.1细胞周期 TP、Paclitaxel及两药联合诱导Eca-109细胞24 h后，细胞周期均发生明显改变，G1期细胞数与对照组比较明显增高(F=54.52,q=5.39～17.53,P<0.05)，而S期与G2期细胞比例减少。见表1。

2.3.2细胞凋亡率 TP组、Paclitaxel组、两药联合组诱导24 h的Eca-109细胞凋亡率分别为(17.54±0.95)%、(10.27±0.93)%、(25.24±0.91)%，差异有统计学意义(F=446.82，q=16.27、31.64，P<0.05)。

2.4 TP和Paclitaxel 对食管癌Eca-109细胞Caspase-3 mRNA表达的影响

与TP组、Paclitaxel组比较，两药联合组诱导24 h后，Eca-109细胞Caspase-3 mRNA的表达量分别增高17.22%、11.63%，差异有显著意义(F=108.33，q=30.37、20.52，P<0.05)。见图6。

3 讨 论

食管癌是全世界高发恶性肿瘤之一，临床确诊时大多数病例已属中晚期，化疗在食管癌的治疗中占重要地位。Paclitaxel为食管癌的临床一线用药，是治疗食管癌最有效的药物之一，但其毒副作用比较严重。在体外，TP可通过选择性阻断信号传导通路、抑制尿酸氧化酶活性等多种途径抑制肿瘤的发生、发展[6]。但TP对食管癌的体外作用以及TP联合Paclitaxel对食管癌的作用国内罕见报道。

细胞增殖失控是恶性肿瘤重要的生物学特征。本文研究显示，TP、Paclitaxel均能显著抑制食管癌Eca-109细胞的增殖，并与时间、浓度呈正相关，这与有关文献报道结果相似[7-8]。而当两药联用时，对食管癌Eca-109细胞的IR明显提高。光镜及流式细胞仪均能观察到细胞凋亡的发生，其中两药联合组更加明显。提示TP能抑制Eca-109细胞生长、诱导细胞凋亡，与Paclitaxel联用能增强其抑制细胞生长、诱导细胞凋亡的作用。

凋亡是细胞的程序化死亡过程，如细胞凋亡受阻可导致肿瘤无限增殖。本文结果显示，Eca-109细胞经TP、Paclitaxel及两药联合作用后，均出现细胞周期阻滞，G1期细胞比例增高，也出现细胞凋亡，表明细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡可能也是TP、Paclitaxel抗肿瘤作用的重要机制之一。

表1 两药对Eca-109细胞周期的影响(n=3,χ/%)

图1 TP对Eca-109细胞IR的影响

图2 Paclitaxel对Eca-109细胞IR的影响

图3 TP、Paclitaxel联合对Eca-109细胞IR的影响

图4 两药联合组Eca-109细胞形态 (×100)

图5 对照组细胞形态 (×100)

M为Marker;①、⑤对照组；②、⑥TP组；③、⑦Paclitaxel组；④、⑧两药联合组。

细胞凋亡是非常复杂的蛋白酶级联反应过程。目前认为药物诱导肿瘤细胞的凋亡受一个或多个基因的调控[9]。众所周知，Caspase-3为与细胞凋亡密切相关的蛋白酶家族[10]。诱导细胞凋亡的典型途径包括：对Caspase-3的依赖性(细胞外途径)和对线粒体靶向性(细胞内途径)，而Caspase-3是两种细胞凋亡途径中的关键酶和执行者，是级联反应的必经之路[11-12]。Caspase-3由12 000和17 000大小两个亚基构成，是编码35 000大小半胱氨酸蛋白酶的基因。TP在诱导肿瘤细胞凋亡的过程中，具有对Caspase-3的依赖性和线粒体靶向性[13]。本文结果显示，随着细胞凋亡率增加，Caspase-3 mRNA表达增加，提示Caspase-3 mRNA的表达与细胞凋亡过程有关，但其信号传导具体途径仍不清楚，可能与Caspase-3的活化相关。由于活化的Caspase-3能特异性地切断DNA，使参与DNA损伤修复过程中的DNA依赖蛋白激酶(DNA-PK)和聚ADP核糖聚合酶(PARP)失活，导致核酸激活和染色质聚集，促使细胞凋亡[14]。ODONKOR等[15]的研究结果表明，Caspase-3依赖性途径是Paclitaxel细胞毒性作用的重要途径，Caspase活化和效能对Paclitaxel治疗肿瘤的敏感性具有良好的指示作用。本研究RT-PCR结果显示，TP组、Paclitaxel组和两药联合组Caspase-3表达均增高，两药联合组作用更明显，这与流式细胞术检测结果一致，提示TP、Paclitaxel诱导细胞凋亡与上调Caspase-3表达有关。

综上所述，TP和Paclitaxel不仅能抑制食管癌Eca-109细胞的分裂，阻滞细胞周期于G1期，使其增殖指数下降，从而抑制细胞的增殖，而且在一定的范围内呈时间、浓度依赖性；同时，二者也可通过上调Caspase-3表达，诱导细胞凋亡，提示Caspase-3 mRNA表达与细胞的凋亡密切相关。但TP、Paclitaxel通过Caspase-3信号传导通路途径诱导细胞凋亡的具体机制并不清楚，尚需更深入的研究。

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