王亚菲 王洁 朱庆春 邱建华

噪声会损伤耳蜗内的听觉感受细胞及一些支持细胞，从而损坏听觉功能。缝隙连接作为细胞之间的连接形式之一，在机体组织细胞间广泛存在，它们在内质网—高尔基体内合成，通过胞内微管泡网络运输到达胞膜，从而组装成缝隙连接［1］。缝隙连接对维持内环境稳态以及细胞间的物质交换具有重要作用。研究还发现在耳蜗中的缝隙连接还参与了钾离子的内淋巴循环［2］。因此，本研究通过观察缝隙连接蛋白在噪声致聋后动物耳蜗内的表达变化，旨在进一步探讨噪声致聋的内在机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 成年雄性Balb／c小鼠49只（购自第四军医大学实验动物中心），体重约8～10g，随机分为噪声组（29只）和对照组（20只）。噪声组给予115dB SPL白噪声（6小时／天，共2天12小时）暴露，对照组不做任何处理。

1.2 主要试剂 兔抗小鼠Cx26 多克隆抗体（Invitrogen，USA），小鼠β－Tubulin 单克隆抗体（Jackson，USA），488荧光标记山羊抗小鼠IgG（Invitrogen，USA），Cy3 标记山羊抗兔IgG（康维世纪），5%正常山羊血清封闭液（武汉博士德），Trizol（Invitrogen，USA），反转录试剂采用PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time（TaKaRa），荧光实时定量PCR 试剂采用SYBRR Premix Ex TaqTM II Perfect Real Time（TaKaRa），以GAPDH 为内参照，GAPDH 引物由宝生物工程公司设计，序列为上游5’－tgtgtccgtcgtggatctga－3’，下游5’－ttgctgttgaagtcgcaggag－3’，GJB2 引物引用文献［3］中的序列，上游5’－catgcaacgtctggtgaaatg－3’，下游5’－gggcctggaaatgaagca－3’。

1.3 主要仪器 电热恒温培养箱，正置显微镜（OLYMPUS），共聚焦显微镜（OLYMPUS FV1000），动物噪声刺激箱，冰冻切片机（LEICA CM1850），ABR 仪（Bio－logic SYSTEMS CORP），实时定量PCR 扩增仪（ABI7500）。

1.4 建立小鼠噪声性聋模型 噪声组29只小鼠分别放在特制鼠笼中，每只小鼠都有独立空间，将鼠笼放入动物噪声刺激箱中，动物噪声刺激箱连接声音放大器，噪声由电脑软件产生并控制，每次给予噪声前均用校准器进行校准，115dB SPL白噪声，每天6小时，共暴露2天。

1.5 ABR 检测 两组小鼠均在实验前检测ABR阈值，噪声组29只小鼠在噪声暴露结束后1小时检测，其中9 只在噪声暴露结束后7 天再行ABR 检测。具体方法如下：于静电屏蔽室内，小鼠腹腔注射2%戊巴比妥麻醉后，将记录电极置于前额正中皮下，参考电极置于待测耳后皮下，接地电极置于尾部皮下。给予click声刺激，刺激叠加1 024次，刺激率为每秒13次，滤波带宽为100～3 000 Hz。测试从90dB SPL 开始，步距5dB，以引出波Ⅲ的最小刺激强度作为ABR 反应阈的标准。

1.6 冰冻切片制备 噪声暴露后4小时，取噪声组及对照组小鼠各2只，麻醉后用多聚甲醛心脏灌注后取出耳蜗，显微镜下去除镫骨，挑破圆窗膜及卵圆窗膜，用吸管向窗内反复吹吸，浸入多聚甲醛液内4℃过夜，经脱钙脱水后，行冰冻切片，片厚10μm。

1.7 免疫组织化学染色 冰冻切片晾干后用0.3%双氧水甲醇灭活内源性酶，PBS清洗后滴加5%正常山羊血清封闭液室温放置1小时；滴加兔抗小鼠Cx26多克隆抗体（1：200）4 ℃过夜；翌日用PBS清洗后滴加生物素标记山羊抗兔IgG（1：800），并置于37 ℃孵育40min；PBS清洗后滴加SABC 工作液37 ℃孵育40min；DAB显色；梯度酒精脱水及二甲苯透明；以PBS代替一抗作阴性对照。中性树胶封片后显微镜下观察，以出现棕黄色颗粒为Cx26 阳性表达。

1.8 间接免疫荧光染色 冰冻切片晾干后经PBS清洗，滴加0.1%Triton－100通透化处理并室温放置15分钟，滴加5%正常山羊血清封闭液室温放置1小时；滴加小鼠β－tubulin单抗（1：250）后4 ℃过夜。翌日用PBS清洗后避光滴加488 荧光标记山羊抗小鼠IgG（1：800），并置于37 ℃孵育40 min；PBS清洗后避光滴加Hochest（1：1 000）衬染胞核；以PBS代替一抗作阴性对照。甘油封片后共聚焦显微镜观察，胞浆呈明亮的绿色荧光为表达阳性，根据其绿色荧光的明亮程度来定性表达的强弱。

1.9 荧光实时定量PCR 小鼠行ABR 检测后，在噪声暴露后4小时内，将噪声组及对照组小鼠各18只颈椎脱臼处死，立即于冰上取出耳蜗外侧壁组织，取出后迅速放入预冷的Trizol中。所取组织称重，使噪声组和对照组的组织量相近，分别抽提总RNA并进行核酸定量。各组样本均吸取1μl总RNA，分别加入反转录体系中合成cDNA，随后各样本分别以1μl cDNA 为反应模板，加入SYBR Premix Ex Taq II 10μl，上游及下游引物各0.5μl，dH2O 8 μl，进行荧光实时定量PCR 反应。反应条件：95 ℃30s，95℃5s，58℃34s，95℃15s，60℃60s，95℃30s，循环40 次。本反应以管家基因GAPDH在小鼠耳蜗外侧壁的mRNA 表达量为内参照，采用2—△△Ct方法对管家基因和Cx26编码基因GJB2两者mRNA 在耳蜗外侧壁的表达量进行相对定量，最后比较各组样本GJB2／GAPDH 的相对表达量。

2 结果

2.1 ABR 反应阈 两组小鼠ABR 反应阈见表1。可见，两组小鼠在噪声暴露前ABR 反应阈差异无统计学意义（P＞0.05）；噪声组小鼠噪声暴露后ABR 反应阈与噪声暴露前和对照组相比较，差异均有统计学意义（均为P＜0.01）；噪声暴露后7 天ABR 反应阈与噪声暴露后0天比较，差异无统计学意义（P=0.782，P＞0.05）。

表1 两组小鼠噪声暴露前及噪声暴露后0、7天ABR 反应阈（dB SPL，±s）

表1 两组小鼠噪声暴露前及噪声暴露后0、7天ABR 反应阈（dB SPL，±s）

注：＊与暴露前及对照组比较，P＜0.01

组别噪声暴露前噪声暴露后0天噪声暴露后7天噪声组 24.23±3.49（58） 71.93±17.05（58）＊ 71.11±6.76（18）＊对照组 23.12±3.73（40）

2.2 免疫组织化学染色观察结果 正常小鼠耳蜗外侧壁有Cx26 表达，主要表达在血管纹下的螺旋韧带处，表达密集处呈斑片状，由血管纹侧向骨壁侧表达逐渐减少，血管纹内未见表达（图1）。噪声组小鼠耳蜗外侧壁可见Cx26表达，但较正常组少（图2）。

2.3 间接免疫荧光染色观察结果 共聚焦显微镜下可见，正常组小鼠耳蜗外侧壁细胞微管排列均匀有序（图3），噪声暴露后小鼠螺旋韧带处细胞微管排列紊乱稀疏，部分区域出现条索状排列，但未见大范围浓集及断裂（图4）。

图1 正常小鼠耳蜗外侧壁免疫组织化学染色结果 可见Cx26主要表达在血管纹下的螺旋韧带，表达密集处呈斑片状，由血管纹侧向骨壁侧表达逐渐减少，血管纹内未见棕黄色颗粒（×400）图2 噪声组小鼠噪声暴露后耳蜗外侧壁免疫组织化学染色结果 可见在血管纹下的螺旋韧带处Cx26表达较正常组减少（×400）图3 正常小鼠耳蜗外侧壁组织β－tubulin染色结果 可见螺旋韧带处细胞微管分布均匀，排列整齐（×200）图4 噪声暴露后小鼠耳蜗外侧壁组织β－tubulin染色结果 可见螺旋韧带处细胞微管排列紊乱稀疏，出现条索状排列，未见大范围浓集或断裂（×200）

2.4 荧光实时定量PCR 结果 对照组GJB2／GAPDH 相对表达量为1，噪声暴露组GJB2／GAPDH 相对表达量为0.658 7±0.143 6，噪声暴露后小鼠耳蜗外侧壁GJB2的平均表达量较对照组降低（P=0.015，P＜0.05），差异有统计学意义，对照组约为噪声组的1.5倍。

3 讨论

缝隙连接蛋白是一种膜蛋白，六个缝隙连接蛋白在内质网和／或高尔基体中经寡聚化后组装成一个半通道——连接子，再经细胞内的微管泡网络转运至胞质膜，最后与相邻细胞膜上的半通道对接形成缝隙连接。这种缝隙连接中央具有直径很小的通道，允许分子量小于1 KDa 的小分子通过，包括Mg2＋、Ca2＋、K＋、IP3、ATP、cAMP、cGMP 等［4］。研究发现GJB2 突变可引起非综合征型语前聋［5～7］，GJB2基因敲除的小鼠Corti器发育障碍［8］，可见缝隙连接蛋白Cx26 在听觉功能中具有重要作用。

文献［9，10］报道高强度噪声会损伤耳蜗内、外毛细胞，最终导致听阈位移，本实验参考文献中常用的噪声暴露条件，适当延长暴露时间，结果显示，噪声暴露后0天小鼠ABR 阈值较对照组升高（P＜0.01），升幅达到48dB；噪声暴露后7天ABR 阈值与噪声暴露后0 天比较，差异无统计学意义（P=0.782，P＞0.05），说明本实验采用的噪声暴露条件造模成功。

Cx26在多种组织中都有表达。本实验观察到，小鼠耳蜗外侧壁有Cx26 表达，其主要表达在血管纹下的螺旋韧带处，与文献［11］报道一致，其分布由血管纹侧向骨壁侧逐渐减少。Forge等［12］还报道，采用Immunogold labeling的方法观察到在血管纹的基底细胞层也有Cx26表达。关于钾离子的内淋巴循环，有学者提出，钾离子离开毛细胞后，通过内耳上皮细胞缝隙连接系统进入毛细胞外侧的其它Corti器细胞中，经螺旋韧带的Ⅱ型纤维细胞摄入后，通过内耳结缔组织细胞缝隙连接系统进入血管纹，随后被分泌入内淋巴［2，13］。内耳结缔组织缝隙连接系统，由血管纹中间细胞、血管纹基底细胞、螺旋韧带纤维细胞、连接听泡骨质的间质细胞、间质暗细胞和螺旋骨板缘的纤维细胞组成［11～13］。因此推测，Cx26参与了钾离子的内淋巴循环，在强噪声刺激下引起耳蜗外侧壁Cx26 表达减少，从而引起钾离子循环障碍，导致听觉功能受损。

内质网是蛋白质合成及修饰的场所，有学者［14］报道给予豚鼠120dB SPL噪声暴露4小时后，引起豚鼠耳蜗内质网应激的特异性关键蛋白酶Caspase－12和分子伴侣Bip／GRP78 表达增加，表明噪声可以引起细胞内内质网功能受损。因此推测，噪声通过损伤耳蜗细胞内质网功能，从而破坏Cx26 的合成场所，导致其合成减少。此外还有学者［15，16］报道，Cx26在胞内的运输依赖未受损的微管。微管存在于所有哺乳类动物细胞中，除红细胞外，均由α和β微管蛋白（tubulin）共同组成。Martin 等［15］在体外培养的HeLa细胞培养基中加入Nocodazole破坏微管后，镜下观察发现培养基中未加Nocodazole的HeLa细胞中，微管呈排列有序的细丝状；而培养基中加入Nocodazole的HeLa细胞中微管碎裂，呈现无结构的浓集染色。本实验发现，噪声导致小鼠耳蜗螺旋韧带细胞微管排列紊乱稀疏，出现条索状排列，但未见大范围浓集或无结构染色，因此相较于Martin等研究中所用的体外培养HeLa细胞药物损伤模型，本实验所用的噪声对微管蛋白的损伤要小很多，因此推测，本实验噪声条件所导致的微管损伤并不是小鼠耳蜗外侧壁Cx26表达减少的主要原因，而内质网功能受损是否是这种表达减少的主导因素还有待进一步研究。

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