陈玉涵 李荣娜 王红霞 曾翔俊 郝 刚▲

1.首都医科大学附属北京佑安医院消化科，北京 100069；2.河北秦皇岛市第三医院内分泌科，河北秦皇岛 066001；

3.首都医科大学，北京 100069

1988 年，Reaven 首次提出X 综合征又称为胰岛素抵抗综合征或代谢综合征（metabolic syndrome，MS），包括胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）、高胰岛素血症、 脂质代谢紊乱以及高血压等综合的病理变化[1]。MS 是多基因和多种环境因素综合作用所致的疾病，患病率逐年上升，已成为当前社会严重威胁人民健康的公共卫生问题。 研究发现，机体可以内源性产生硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）并完成一定的生理功能。生理浓度的H2S 与气体分子一氧化氮、一氧化碳在部分生物学功能方面相同或相似，因此，它被看作体内第三种的气体信号分子。 H2S 是以L-半胱氨酸为底物，在胱硫醚-β-合酶（cystathionine-β-synthase，CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶 （cystathionine-γ-lyase，CSE）的作用下产生，广泛参与诸多的疾病的发病与转归[2]。研究表明， 外源性H2S 治疗可减轻高糖引起的ROS 产物的级联反应，减轻DNA 的损伤[3]，外源性H2S 能抑制高浓度葡萄糖引起的心肌细胞损伤[4]，可以抑制胰岛素分泌和成熟脂肪细胞对葡萄糖的摄取[5]。 笔者前期研究工作也发现，MS 小鼠内源性H2S/CSE 体系受到严重抑制，因此推断H2S 参与了MS 小鼠血糖和胰岛素水平的调节。

基于以上问题，本实验选用KK/Upj-Ay/J 小鼠作为MS 小鼠动物模型， 观察H2S 供体NaHS 对血糖和血胰岛素水平的影响，以及NaHS 对C2C12 骨骼肌细胞葡萄糖摄取能力的影响，并通过观察NaHS 对小鼠胰岛瘤细胞（NIT-1 细胞）胰岛素分泌的影响，对机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物和细胞

MS 模型雄性KK/Upj-Ay/J 小鼠（8～10 周）由中科院动物所提供（动物质量合格证号：SCKK2004-0001）；正常对照雄性C57BL/6J 小鼠（8～10 周）由中科院动物所提供（动物质量合格证号：SCKK2005-0013）；小鼠胰岛瘤（NIT-1）细胞由首都医科大学病理生理教研室赠予；小鼠C2C12 骨骼肌细胞株购自上海中科院细胞库。

1.2 试剂

硫氢化钠（sodium hydrosulfide，NaHS）购自美国Sigma 公司；2-脱氧荧光葡萄糖（2-NBDG，2-[N-（7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diazo l- 4- yl）amino]-2-deoxy-D-glucose） 购自Invitrogen 公司。

1.3 方法

1.3.1 实验分组 8～10 周的雄性KK/Upj-Ay/J 小鼠随机分为MS+NaHS 组和MS 组，每组各6 只。MS+NaHS组每日每只腹腔注射0.25 mL H2S 供体NaHS（78 μmol/kg）；MS 组每日每只注射等量生理盐水。 取同周龄健康雄性C57BL/6J 小鼠10 只作为正常对照组（CON 组），注射等量生理盐水。 连续给药4 周。

1.3.2 空腹血糖和胰岛素的测定 小鼠尾尖取血，强生ONE TOUCH Ultra 血糖仪测定血糖值。胰岛素测定由解放军总医院科技开发中心放免所采用放射免疫分析法完成。

1.3.3 肥胖指标和血脂的测定 取材前腹腔注射4%水合氯醛麻醉（0.8 mL/100 g），测量体重、腹围和体长并计算Lee 指数。 体长即小鼠麻醉后仰卧，从鼻尖到肛门的长度。Lee's 指数=[体质量（g）]1/3/体长（cm）×1000。取肾周、 肠系膜、 附睾处脂肪称重并计算脂肪系数（VFC）。 VFC （%）=内脏脂肪湿重（viceral fat mass，VFM）/体重（BW）。做颈总动脉插管取血，EDTA 抗凝，1500 r/min 离心10 min， 取上清液分装入冻存管中，-80℃保存，全自动生化分析仪测定血脂各项指标。

1.3.4 2-NBDG 摄取实验[6]将小鼠C2C12 骨骼肌细胞株采用DMEM 培养基培养， 于细胞培养箱内95%空气5% CO237℃恒温培养，取同批单层培养细胞吸去原培养液后，用无血清培养基饥饿24 h，换用含5%新生牛血清的培养基， 取同批单层培养细胞分为A、B、C、D、E 5 组， 分别加入不同浓度的NaHS（0、50、100、200、400 mmol/L），培养1 h 后，弃去培养液，0.01 mol/L PBS 冲洗3 遍， 加入200 μmol/L 2-N BDG 培养20 min 后，弃去2- NBDG 液，0.01 mol/L PBS 冲洗3 遍，将玻片小心取出，放置在荧光显微镜下观察，激发光波长488 nm，发射光波长540 nm，可观察到细胞内有绿色荧光。各浓度NaHS 组选3 个皿，每皿随机选取6个视野拍照，实验重复3 次，用Imagepro Plus 6.0 软件对荧光积分光密度（IA）进行统计分析。

1.3.5 小鼠NIT-1 细胞胰岛素分泌功能的测定[7]采用DMEM 培养基，于细胞培养箱内95%空气5%CO237℃恒温培养。 取同批单层培养细胞分别加入不同浓度NaHS（0、50、100、200、400 mmol/L），培养1 h 后弃去培养液， 用含5.6 mmol/L 葡萄糖的DMEM 培养基培养24 h 留取培养液，-20℃贮存，待测胰岛素含量。 然后行葡萄糖刺激的胰岛素释放试验，每个皿弃去培养液后加入含16.7 mmol/L 葡萄糖的KRBB 液刺激1 h后，留取培养液，待测胰岛素含量。

1.3.6 MS 诊断标准 采用2005 年4 月国际糖尿病联盟（International Dabetes Federation，IDF）颁 布 的MS国际统一诊断标准，即在中心性肥胖基础上具备以下4 项中的任何2 项：三酰甘油水平升高，高密度脂蛋白胆固醇水平降低，血压升高，空腹血糖升高[8]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0 统计学软件进行数据分析， 计量资料数据用均数±标准差（s）表示，多组间比较采用单因素方差分析， 组间两两比较采用LSD-t 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MS 模型的评价

与CON 组小鼠相比，KK/Upj-Ay/J 小鼠的肥胖指标：腹围和Lee's 指数显著增加；空腹血糖和胰岛素水平分别增高236.9%和310.3%（P ＜0.01）； 血脂指标中总胆固醇升高131%，三酰甘油升高141%，低密度脂蛋白胆固醇升高76%，高密度脂蛋白胆固醇水平升高160%（均P ＜0.01）（表1）， 符合MS 诊断标准，说明MS 模型选择成功。

2.2 NaHS 对血糖和血胰岛素水平的影响

给予NaHS 4 周后，MS+NaHS 组小鼠空腹血糖和胰岛素比MS 组分别降低了24.2%和46.98%（P ＜0.05），提示NaHS 可以改善MS 的的高糖高胰岛素水平。见表2。

2.3 NaHS 对骨骼肌细胞摄取2-NBDG 的影响

加入2-NBDG 20 min 后， 荧光显微镜下观察可见，不同浓度NaHS 干预后，骨骼肌摄取2-NBDG 增加，荧光IA 值C、D 组与A 组比较差异有高度统计学意义（P ＜0.01），B、E 组与A 组比较差异有统计学意义（P ＜0.05），其由大到小排序依次为C 组＞D 组＞B组＞E 组＞A 组。 NaHS 浓度为100 mmol/L 时，骨骼肌摄取葡萄糖量达到最大值。 见图1、2。

表1 代谢综合征模型评价指标（s）

表1 代谢综合征模型评价指标（s）

注：与CON 组比较，*P ＜0.01；FBG：空腹血糖；FIns：空腹胰岛素；TC：总胆固醇；TG：三酰甘油；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇

CON 组（n=10）MS 组（n=6）7.87±0.63 10.00±0.59*302.69±22.75 338.26±25.64*6.67±0.56 22.47±5.89*56.19±19.63 230.53±91.00*2.52±0.17 6.26±0.47*0.98±0.22 2.20±0.89*1.28±0.11 3.59±0.30*0.44±0.09 0.81±0.06*

表2 硫氢化钠对代谢综合征小鼠空腹血糖和胰岛素的影响（s）

表2 硫氢化钠对代谢综合征小鼠空腹血糖和胰岛素的影响（s）

注：与MS 组比较，#P ＜0.05

MS 组（n=6）MS+NaHS 组（n=6）22.47±5.89 17.03±6.77#230.53±91.00 122.22±33.04#

图1 C2C12 细胞对2-NBDG 的摄取（×20）

图2 各组2-NBDG 摄取的IA 值比较

2.4 NaHS 对NIT-1 细胞胰岛素分泌功能的影响

在低糖（5.6 mmol/L 葡萄糖）刺激下，不同浓度NaHS对胰岛细胞胰岛素分泌水平无明显影响。 在高糖（16.7 mmol/L 葡萄糖）刺激下，不同浓度NaHS 干预后，胰岛素分泌水平差异有统计学意义（P ＜0.05），且随着NaHS水平的升高，胰岛素分泌水平下降越明显。 见表3。

表3 不同浓度NaHS 对NIT-1 细胞胰岛素分泌的影响（s）

表3 不同浓度NaHS 对NIT-1 细胞胰岛素分泌的影响（s）

注：与NaHS 0 mmol/L 比较，*P ＜0.05

NaHS（mmol/L）0 50 100 200 400 5.6 16.7 13.5±0.2 16.3±2.1 13.2±0.5 14.2±0.8*12.2±1.3 13.4±1.2*12.8±0.6 13.1±0.8*12.3±1.2 12.7±1.0*

3 讨论

与CON 组相比，KK/Upj-Ay/J 小鼠的肥胖指标体重、腹围、Lee's 指数和空腹血糖、胰岛素以及三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇均显著升高（P <0.01），这与MS 诊断标准相符，说明本实验选用的MS模型是成功的。

近年来，H2S 在胰岛素抵抗及糖尿病发生发展中的作用越来越受到人们关注。在本实验中MS 组小鼠空腹血糖和胰岛素水平均比CON 组显著升高（P<0.05），而给予NaHS 4 周后，MS+NaHS 组小鼠血糖和胰岛素分别比MS 组降低了24.2%和46.98%。 推测H2S 可能是通过增加胰岛素靶器官对葡萄糖的摄取和利用来达到降低血糖的作用。 因此，本研究进一步观察了NaHS对骨骼肌细胞葡萄糖摄取量的影响，结果表明，不同浓度的NaHS 干预后， 骨骼肌摄取葡萄糖增加 （均P ＜0.05），NaHS 浓度为100 mmol/L 时， 骨骼肌摄取葡萄糖量达到最大值。 表明H2S 可以通过提高胰岛素敏感性，促进骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取来降低血糖。

高胰岛素血症是在胰岛素抵抗的状态下，胰岛B细胞代偿性分泌胰岛素增加的结果，不仅会导致胰岛B细胞功能的下降，还会损伤血管内皮细胞，加速冠状动脉粥样硬化形成，导致左心室肥厚[9]，是冠心病、高血压、高血脂、Ⅱ型糖尿病、肥胖、脑卒中等共同的发病基础。 研究表明，不同浓度的H2S 对胰岛B 细胞具有不同作用，低浓度的H2S 可通过ATP 敏感性K 通道（KATP）和不依赖于KATP 通道的其他机制抑制胰岛素释放， 高浓度的H2S 可通过内质网应激通路导致胰岛B 细胞坏死[3，10]。本实验结果表明，外源性给予NaHS 后，小鼠血清胰岛素水平均比MS 组降低（P ＜0.05），NIT-1 细胞在加入NaHS 后，胰岛素分泌水平下降（P ＜0.05），且随着外源性NaHS 浓度的增加，胰岛素分泌下降越明显，说明外源性NaHS 还可以抑制MS 的高胰岛素分泌。

综上所述，H2S 可以通过提高胰岛素敏感性，促进骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取来降低血糖，从而改善了高血糖刺激高胰岛素血症发展的恶性循环，抑制胰岛素分泌； 同时，H2S 在高糖条件下可以直接抑制胰岛素分泌， 改善了MS 小鼠的高胰岛素状态。 另外，H2S 还作为体内的“调停器”减轻高糖环境对胰岛细胞造成的损害[11]。 因此，外源性H2S 可能通过多个方面在MS 小鼠中发挥血糖调节的重要作用。

[1] Reaven GM. Role of insulin resistance in human disease [J].Diabetes，1988，37（12）：1595-1607.

[2] Viktoria J，Edina K，Emoke N，et al.Supression of hemin-medi ated oxidation of low-density lipoprotein and subsequent endo thelial reactions by hydrogen sulfide（H2S）[J]. Free Radic Biol Med，2009，46（5）：616-623.

[3] Suzuki K，Olah G，Modis K，et al.Hydrogen sulfide replacement therapy protects the vascular endothelium in hyperglycemia by preserving mitochondrial function[J].Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（33）：13829-13834.

[4] 林春喜，林建聪，郭润民，等.硫化氢通过调控 通路对抗高糖诱导的心肌细胞氧化应激损伤[J].中国动脉硬化杂志，2013，21（1）：1-5.

[5] Feng X，Chen Y，Zhao J，et al. Hydrogen sulfide from adipose tissue is a novel insulin resistance regulator[J].Biochem Biophys Res Commun，2009，380（1）：153-159.

[6] 吴璇，刘洪臣，吕娇，等.胰岛素对糖尿病大鼠下颌骨成骨细胞糖摄取的影响[J].口腔医学研究，2010，26（3）：346-348.

[7] 陈宏，蔡德鸿，王梅，等.一氧化氮介导的细胞因子对大鼠胰岛素分泌的影响[J].中华内分泌代谢杂志，1998，14（4）：263-266.

[8] 宋秀霞，纪立农.国际糖尿病联盟代谢综合征全球共识定义[J].中华糖尿病杂志，2005，13（3）：178-180.

[9] Grundy SM，Cleeman JI，Daniel SR，et al. Diagnosis and mana gement of the metabolic syndrome：an American Heart Associ ation/National Heart，Lung，and Blood Institute scientific state ment：Executive Summary[J].Circulation，2005，112（17）：2735-2752.

[10] Yang G，Yang W，Wu L，et al.H2S，endoplasmic reticulum stress,and apoptosis of insulin-secreting beta cells[J].J Biol Chem，2007，282（22）：16567-16576.

[11] Kaneko Y，Kimura T，Taniguchi S，et al.Glucose-induced produ ction of hydrogen sulfide may protect the pancreatic beta-cells from apoptotic cell death by high glucose[J].FEBS Lett，2009，583（2）：377-382.