喻春钊 余 翔 王兴伟 骆霞岗 李 泉 竺 慧 王伟林

南京医科大学第二附属医院普通外科，江苏南京 210011

胰腺癌是一种恶性程度高、进展迅速、手术切除率低、预后极差的恶性肿瘤，术后5 年生存率为3%～8%[1]。 究其原因主要是因为胰腺癌发现时已经处于局部中晚期，存在胰周临近许多重要器官的直接浸润和转移， 如何进一步寻找更加有效的治疗手段和方法，抑制胰腺癌的侵袭和转移对于提高胰腺癌的治疗效果和预防复发有着重要的作用和意义[2]。 人类Plk1 基因于1994 年由GoIsteyn 等[3]最先克隆报道，定位于16p12.3，mRNA 长约2.2 kb， 编码的蛋白质分子量约为67 kd。 本研究以Plk1 为靶基因，采用RNAi 技术沉默Plk1 基因表达， 观察其与胰腺癌细胞侵袭转移能力的关系及对细胞凋亡的影响，以期为胰腺癌的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

鼠抗人Plk1 单克隆抗体（美国Zymed 公司），兔抗人Plk1 多克隆抗体 （美国Calbiochem 公司），PCR 引物和shplk1-1、shplk1-2、shplk1-3、shplk1-4 由上海钰森生生物试剂公司合成；小牛血清，RPMI 1640 培养基（Gibco 公司），RNA 酶A（RNaseA）（Sigma 公司），Trizol（MRC 公司），总RNA 提取试剂盒（美国Promega 公司），反转录试剂盒Reverse Transcription System（美国Promega 公司），Rneasy Mini Kit（美国QIAGEN 公司），DL2000 DNA Marker，RT-PCR 试 剂 盒TaKaRa Taq（日本TaKaRa 公司），孔板，24 孔板（Costar 公司），琼脂糖（美国Merck 公司），细胞裂解用蛋白酶抑制剂混合片（Roche 公司），化学发光检测试剂盒（安玛西亚公司），Matrigel 胶购自美国BD 公司，Transwell 小室系统购自美国Coster 公司，产品其他常用试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞培养及转染

胰腺癌细胞株AsPC-1 购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库， 细胞分别置于含10%小牛血清， 抗生素（含100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 链霉素）和2 mmol/L 谷胺酰胺的RPMI 1640 培养液中，在37℃、%CO2、湿度为95%的恒温培养箱中培养，每隔2～3 d 传代1 次。 实验选用对数生长期的细胞，用0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）混合消化液消化，用含10%的小牛血清RPMI-1640 培养液稀释成单细胞悬液（106/mL）以4000 细胞/孔接种于6 cm 培养皿中进行实验，将实验分为对照组（未处理组）、空质粒组、shplk1-1 组、shplk1-2 组、shplk1-3 组、shplk1-4组， 应用Invitrogen 公司转染试剂盒按说明书进行转染，培养48 h 后提取总Plk1 RNA 和蛋白。

1.3 RT-PCR 检测目的基因Plk1 mRNA 的表达

用Rneasy Mini Kit 试剂盒提取各实验组细胞总RNA，按照Promega 公司的反转录试剂盒操作手册进行反转录。 Plk1 引物序列：上游引物5'-AAGAGATCCCGGAGGTCCTA-3'；下游引物5'-TCATTCAGGAAA AGGTTGCC-3' 产物长度450 bp。 扩增条件： 预变性94℃5 min，94℃30 s，63℃45 s，72℃1 min，30 个循环，最后72℃延伸10 min。 以β-actin 为内参，引物序列：上游引物5'-AAAGACCTGTACGCCAACAC-3'；下游引物5'-GTCATACTCCTGCTTGCTGAT-3' 产物长度219 bp。 PCR 产物在1%琼脂糖凝胶上分离，通过Bio-Rad 公司凝胶分析软件分析条带光密度。

1.4 Western blot 检测目的基因Plk1 蛋白的表达

收集“1.3 项”下同期处理的细胞提取蛋白。 细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次后加入150 μL 细胞裂解液 （50 mmol/L Tris-Cl，150 mmol/L NaCl，0.02%叠氮钠，0.1%SDS，100 μg/mL 苯甲基磺酰氟，1 μg/mL Aprotinin，1% Nonidet P-40，0.5%去氧胆酸钠）， 冰上静置20 min。 用细胞刮匙将细胞从培养皿中刮落，收集于Ep 管中，置冰上超声细胞粉碎仪超声处理20 s。12 000 r/min，4℃离心15 min，收集上清，用Bio-Rad公司的DC Protein Assay 试剂盒进行蛋白定量。 以总蛋白量20 μg/孔进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳完毕，将凝胶上的蛋白用湿转移法转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。 膜用含5%脱脂牛奶的TBS 室温封闭1 h，TBS 洗3 遍，加以封闭液稀释的抗Plk1 抗体（1∶200）和抗β-actin 抗体（1∶500），4℃过夜，TBS 洗3 遍，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗孵育 （1∶3000）1 h，ECL 化学发光，暗室曝光显影，计算机分析。

1.5 Transwell 肿瘤细胞侵袭实验

将放于4℃过夜融化的Matrigel 胶用无血清培养基按比例为1∶3 稀释配成胶，将小室放在24 孔板内，每个小室加入80 μL 稀释好的Matrigel 胶， 分3 次铺，每次间隔10 min，每次铺完胶后在37℃下干燥；最后一次干燥10 min 后，在上层小室内分别加入4组细胞（未处理组、空质粒组、shplk1-3 组和对照组）各100 μL（浓度为1×106/mL）个。 下层小室各加入10%的FBS，于37℃，5%CO2条件下培养72 h；每组细胞设3 个复孔，实验重复3 次，弃去上室中的培养液，并擦去Matrigel 胶，滤膜冰甲醇固定1 min 后行苏木精-伊红染色（HE），棉棒轻轻擦去滤膜顶层的细胞，进行侵袭实验结果观察：各选择5 个无重叠区，于高倍镜（200×）下摄片，同时分别计数24 孔板中的细胞数，结果以均值表示。

1.6 细胞迁移实验

取传代48h 长势良好的两组细胞（空质粒组和shplk1-3 组）制备单细胞悬液，按1×105个细胞（500 μL）/孔将细胞加入6 孔板，5%CO2培养箱内于37℃孵育培养。采用划痕法用消毒过的枪头在80%汇合的单层细胞表面划出一无细胞的细痕，用PBS 漂洗3 次以除去划下的细胞，加入新鲜无血清培养液继续培养观察12、24 h，在倒置显微镜下观察拍照。

1.7 统计学方法

采用统计软件SPSS 12.0 对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t 检验。 以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR 检测各组细胞Plk1 mRNA 的含量

以β-actin 作为内对照， 比较Plk1 的条带差异明显，对照组、空质粒组、shplk1-1 组、shplk1-2 组、shplk1-3 组、shplk1-4 组的Plk1 mRNA 相对量分别为（2.38±0.19）、（2.14±0.16）、（1.96±0.14）、（1.82±0.17）、（1.22±0.12）、（1.56±0.15），shplk1 转染各组Plk1 mRNA 的表达低于对照组和空质粒组， 其中以shplk1-3组Plk1 mRNA 相对量最低，与各组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。 见图1。

图1 RT-PCR 检测各组细胞Plk1 mRNA 含量比较

2.2 Western blot 法测定Plk1 蛋白的表达

以β-actin 为内参，可见68 kd 左右的蛋白带，它与Plk1 抗体特异性结合，证明为Plk1 表达的蛋白，对照组、 空质粒组、shplk1-1 组、shplk1-2 组、shplk1-3组、shplk1-4 组的Plk1 相对量分别为（1.243±0.143）、（1.122±0.121）、（0.953±0.018）、（0.775±0.020）、（0.275±0.154）、（0.543±0.125），shplk1 转染各组Plk1 蛋白相对量相对较低， 其中以shplk1-3 转染组显著低于其它各组（P < 0.01）。 见图2。

图2 Western blot 检测各组细胞Plk1 蛋白表达比较

2.3.Transwell 侵袭实验

对照组、 空质粒组、shplk1-3 组穿过人工基底膜的侵袭细胞数分别为（195±16）、（176±13）、（83±5）个（图3）。 结果显示， 稳定转染后的shplk1-3 组穿过Matrigel 胶的侵袭细胞数较空质粒组和对照组明显减少（图4），方差分析显示差异有高度统计学意义（P<0.01）；而其余两组组间差异无统计学意义（P > 0.05）。

图3 三组细胞侵袭能力比较

图4 三组细胞穿过人工基底膜图

2.4 细胞迁移实验

在两组细胞内划出相同宽度的痕迹后，空质粒组比shplk1-3 组细胞迁移速度快，12 h 后，空质粒组已侵入近1/2 距离，而shplk1-3 组仅侵入1/3 左右，24 h后空质粒组已经基本融合，而shplk1-3 组仅侵入1/2左右（图5）。 结果表明，shplk1 组细胞迁移能力明显低于对照组。

图5 两组细胞在0、12、24 h 的迁移图

3 讨论

胰腺癌是一种恶性度很高的肿瘤，临床上虽然采取了手术、化疗、放疗等多种治疗方法，但疗效却不十分理想，重要原因是胰腺癌发现时已经处于局部浸袭和转移，进一步研究和探讨胰腺癌侵袭转移的作用机制仍然是胰腺癌治疗研究领域的难点和热点[4]。 RNAi技术在肿瘤上的研究已经取得较大进展，目前大多数学者通过RNAi 沉默癌基因、 促进肿瘤细胞的凋亡、调控细胞周期、对肿瘤新生血管的干预以及对参与肿瘤放化疗过程中与耐药相关的特定基因的干预来研究肿瘤中特定基因的功能与探索相关的治疗手段[5]。多项研究表明，Plk-1 在胰腺癌、直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌甲状腺癌、鼻咽癌、子宫颈癌、肝转移癌及前列腺癌组织中过表达，其过表达与肿瘤组织分级、恶性程度及预后密切相关[6-11]。 Plk-1 是一种存在于哺乳动物细胞中的丝/苏氨酸蛋白激酶， 通过参与调控细胞周期G2/M 期检测点的功能对细胞周期的运行发挥重要作用，Plk-1 对控制细胞基因组的稳定性和染色体分配能有效抑制肿瘤细胞增殖与分裂，Plk1 已被作为重要的分子药物治疗靶点[12-14]。 笔者前期研究已经发现， 中心体Plk1 在胰腺癌组织细胞中的高表达与其多药耐药机制密切相关，用RNAi 技术降低Plk1 的表达增强胰腺癌细胞对化疗药物的敏感性[5，15]。 但是通过下调Plk1 的表达能否抑制胰腺癌细胞的侵袭和转移能力目前没有报道，因此本研究采用RNAi 干预Plk1 的表达， 研究靶向抑制Plk1 治疗胰腺癌的可行性， 为胰腺癌的治疗寻找一种新方法[16]。在本试验中， 采用针对Plk1 的RNAi 来干预Plk1 的表达， 通过检测转染shplk1 的胰腺癌细胞， 来进行Plk1 mRNA、Plk1 蛋白质表达的检测，发现在转染shplk1-3 的AsPC-1 细胞中Plk1mRNA 和蛋白质水平明显低于未处理组、空质粒组和对照组，表明构建的shplk1-3 能够明显的抑制Plk1 的表达； 同时对该株细胞进行了细胞迁移和侵袭实验， 发现与空质粒组、未转染组以及对照组相比，转染shplk1-3 的AsPC-1，生长明显变慢、活性降低、侵袭能力减弱，显示出其对胰腺癌细胞良好的干预作用。 从而进一步证明Plk1可以作为胰腺癌治疗的一个良好靶点， 提示对Plk1的干扰可能是一个有深远前景的治疗肿瘤的策略。

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