董志国 ，李晓英，张庆起，阎斌伦，孙效文

(1.淮海工学院，江苏省海洋生物技术重点建设实验室，连云港 222005;2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306;3.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，哈尔滨 150001;4.赣榆县海洋渔业技术指导站，连云港 222100)

三疣梭子蟹(Portunus tritubeirculatus)是一种重要的海洋经济动物，隶属甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)，是目前世界上最主要的捕捞蟹类。FAO 2010年数据显示全世界三疣梭子蟹年捕捞产量超过38万t［1］。中国海梭子蟹资源丰富，在过去几十年，三疣梭子蟹的捕捞产量不断增长，2010年我国梭子蟹海洋捕捞产量约为35万t，随着育苗技术和养殖技术的突破，养殖产量在2010年已达9.1万t，养殖面积达3万hm2［2］。海州湾位于江苏连云港，是中国沿海三疣梭子蟹天然资源的主要渔场之一，但随着1993年对虾养殖病害大规模暴发，产量大幅度下降之后，海湾湾近岸开发以梭子蟹为主进行池塘养殖，建设了万亩梭子蟹基地，并带动周边养殖面积达1700 hm2以上。作为主要的渔业资源，2009年增殖放流三疣梭子蟹583.9万只，之后每年都有增殖放流活动。但近年来的大面积池塘养殖和增殖放流对野生资源的遗传影响尚不明确，特别是放流亲本的选择及其遗传背景均少有关注。已有研究表明，三疣梭子蟹的养殖群体与野生群体在繁殖性能上存在着明显差异，在卵的孵化率、胚胎发育时间和幼体成活率方面野生三疣梭子蟹要优于池塘养殖群体［3］。对大西洋鲑(Salmo salar L.)野生和养殖群体及其杂交后代研究表明虾青素含量存在明显的差异，且是由于遗传因素影响所致［4］。对浙江三门养殖青蟹 (Scylla paramamosain)和野生青蟹的遗传差异研究发现群体的遗传多样性均很高，但产生子一定程度的分化［5］。而对于三疣梭子蟹养殖群体与野生群体的遗传分析还未见报道，仅有三疣梭子蟹养殖群体同工酶的组织特异性及生化遗传分析的研究报复［6］。而且，近10年来，在海州湾开展三疣梭子蟹规模化养殖和近年开展的人工放流活动并存，但这些活动对天然资源的遗传影响还未有研究报道，但增殖放流过程中对放流群体开展遗传评价已成为一种常规和必须的任务［7］，但目前我国还很少有关注。因此，本研究利用SSR分子标记技术，探明近岸三疣梭子蟹养殖活动对天然资源的影响程度，对于渔业资源的评价、管理与保护具有重要的科学价值。

1 材料与方法

1.1 样本采集

试验用三疣梭子蟹野生种群系2011年11月采集于海州湾自然海区，两个养殖群体均采自海州湾所属海头镇万亩梭子蟹养殖基地，基地所用苗种均为连云港本地育苗场多年繁殖苗种后代，其亲本为养殖蟹多代繁殖后代。3个群体均为当年商品蟹，雌雄随机各30只。采集到的三疣梭子蟹活体运回实验室，－70℃低温冰箱保存。

1.2 DNA提取与PCR扩增、测序

取附肢肌肉组织约50 mg，先用蒸馏水将组织清洗干净，按照常规的酚－氯仿法提取DNA［8］。扩增反应体系15μL，包括:2×PCR Mixture，正反向引物各0.2 pmoL/L、约100 ng基因组DNA。扩增程序为:94℃预变性4 min;94℃变性30 s，50—60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环;72℃延伸6 min，4℃保存。试验所用微卫星引物见表1。

表1 用于PCR扩增的20个三疣梭子蟹微卫星分子标记Table 1 Characterization of twenty microsatellite loci in Portunus trituberculatus

PCR扩增产物经12%聚丙烯酰胺凝胶检测，电泳缓冲液为l×TBE(pH值8.0)，常温电泳后银染，显色后于扫描仪下观察并拍照记录。

1.3 数据分析

用Gel－Pro analyzer对显色后的SSR扫描电泳图谱进行统计分析，每一个条带视为一个位点，最高位点记作位点A，其次为B，以此类推;利用Pop32软件计算等位基因频率(N)、有效等位基因数(Ne)、期望杂合度(He)，观察杂合度(Ho)并分析F统计量、基因流(Nm)、种群遗传一致度(I)和遗传距离(Ds)，并运用非加权算术平均法(UPGMA)对3个群体进行聚类分析;应用中LittleProgram计算多态信息含量(PIC);使用TPFGA程序构建系统发生树;应用STATISTICA 99'对群体的遗传参数进行单因子方差分析，并在进行0.05水平的Duncan检验。

2 结果与分析

2.1 海州湾三疣梭子蟹养殖群体与野生群体的遗传多样性

20个微卫星位点在3个三疣梭子蟹群体扩增结果列于表2，20个位点在3群体中的等位基因数为2—7，其中野生群体的平均等位基因数5，而两个养殖群体的等位基因平均分别为3.35和2.9。根据Botstein等提出的衡量基因变异程度高低的多态信息含量指标(PIC)，20个位点除SZX14在野生群中具有较高的无效基因(null allele)外，其余均为高度多态位点，说明这20个微卫星位点可以用于三疣梭子蟹种群遗传学的研究［9］。基于20个微卫星位点的3群体有效等位基因数(Ne)、期望杂合度(He)、观察杂合度(Ho)以及PIC见图1，显示遗传多样性最高的是野生种群，Ho=0.8509，而两养殖群体的杂合度低于野生群体，Ho分别为0.4525和0.5283。经单因子方差分析显示海州湾野生三疣梭子蟹的 Ne、Ho、He、PIC均显著高两养殖群体(P＜0.05)，但两养殖群体的Ne、Ho、He、PIC均无显著差异(P＞0.05)。以上结果说明海州湾天然三疣梭子蟹群体的遗传多样性显著高于养殖群体。

2.2 海州湾三疣梭子蟹养殖群体与野生群体的遗传渐渗状况

海州湾三疣梭子蟹养殖群体与野生群体间的基因流(Nm)和遗传分化指数Fst如表3所示。3群体的Fst为0.1085—0.1448，处于中度分化状态，Nm处于1.5—2.0。野生群体与养殖群体的遗传分化要较养殖群体内部之间更大，基因流也较养殖群体内部之间要小，表明野生群体与养殖群体存在一定的分化，基因流处于中等程度。

图1 三疣梭子蟹群体遗传信息差异Fig.1 Difference of genetic characterization of P.trituberculatus stocks

2.3 海州湾三疣梭子蟹养殖群体与野生群体的遗传系统关系

海州湾三疣梭子蟹养殖群体与野生群体间的Nie's无偏遗传距离见表4，结果显示野生群体与养殖群体的遗传距离较大，在0.5以上，而养殖群体间的遗传距离为0.3223，说明野生群体与养殖群体具有一定的分化。图2为三群体的聚类图，养殖群体间的距离更近，聚类为一支，野生群作为独立的一支。

3 讨论

3.1 海州湾三疣梭子蟹的遗传多样性

图2 海州湾三疣梭子蟹养殖群体与野生群体的聚类分析图Fig.2 Diagram of cluster analysis of cultured and wild stocks of P.trituberculatus in Haizhou Bay

表3 海州湾三疣梭子蟹养殖群体与野生群体的遗传分化与基因流Table 3 Fst and Gene flow of P.trituberculatus of cultured and wild stocks in Haizhou Bay

表4 海州湾三疣梭子蟹养殖群体与野生群体的Nie's无偏遗传距离Table 4 Nie's unbias genetic distancest and Gene flow of P.trituberculatus of culture and wild stocks in Haizhou Bay

中国自然海区三疣梭子蟹的遗传多样性相对比较丰富，大量的研究结果证实了这一结论［10－13］，但遗憾的是较少有人关注人工养殖和增殖放流对资源的遗传影响，这可能与我国开展三疣梭子蟹养殖与人工放流时间较短有关，也与三疣梭子蟹标志物应用局限有关。本研究结果显示20个位点在3群体中的等位基因数为2—7，其中野生群体的平均等位基因数5，而两个养殖群体的等位基因平均分别为3.35和2.9，这一结果低于青蟹东海三门湾野生群体(9.83)与浙江三门养殖群体(6.23)［5］，但符合Liu等对黄渤海6个野生三疣梭子蟹群体的结果(2.5—6.5)［14］，这说明三疣梭子蟹等位基因数低于青蟹，可能与不同种类有关。海州湾三疣梭子蟹天然群体的遗传多样性都较高，Ho高达0.8509，略高于青岛、东营、潍坊和日照野生群体的Ho值(0.71—0.83)［14］，而本研究中两养殖群体的杂合度则低于上述黄渤海区野生群体，Ho分别为0.4525和0.5283，但养殖群体的杂合度略低于三门青蟹养殖与野生群体相近(H=0.56—0.58)。本研究结果显示海州湾天然三疣梭子蟹群体的遗传多样性显著高于养殖群体，但两独立的养殖群体的Ne、Ho、He、PIC均无显著差异(P＞0.05)，这说明海州湾的野生资源遗传多样性较好，明显好于养殖群体。这可能是由于人工养殖和增殖放流的效应时间还比较短，而养殖群体可能用于人工繁殖的有效亲本相对较小，从而导致群体遗传多样性下降。而这种遗传多样性的差异存在，更提示了开展天然种质资源保护的必要性，要采取措施防止养殖三疣梭子蟹进入到天然水环境，同时也要对增殖放流的繁殖群体采用野生捕捞的遗传多样性高的大群体进行繁殖，以避免由于有效繁殖群体过小产生遗传漂变。另外，长期来讲还需要加强养殖群体和天然群体的遗传监测。遗传多样性是生物进化和维持物种防止灭绝的根本，其大小程度代表了物种的进化潜力和环境的适应程度。国内对野生动物遗传多样性的研究主要在濒危物种中开展［15－16］，旨在通过分析其遗传多样性现状，制定出更有效的保护措施，与前述众多研究者所用AFLP和D－Loop分子标记的研究结果一致，海州湾三疣梭子蟹的遗传多样性较高，具有种质保护与遗传育种选育的潜力。

3.2 规模化养殖对海州湾三疣梭子蟹的遗传渐渗

微卫星标记具有多态性高，在基因组中随机分布、共显性遗传以及检测手段经济简便等诸多优点而成为分子群体遗传学的首选研究手段［17］，特别是研究生物不居群的相互关系。Wilson通过微卫星标记技术研究斑驴蚌(Dreissena bugensis)引入到加拿大劳伦湖的种群扩散模式时发现斑驴蚌从引入点到大湖(Great Lake)最低处这一过程是以跳跃式为扩散途径，已有的资料显示为渐进式扩散，显示出该种贝类具有多种扩散模式，而在对斑马蚌的研究中则显示为跳跃式扩散［18］。Therriault应用微卫星标记研究了原产于北黑海Dnieper和Bug Limans的斑驴蚌引入途径证实该贝是以跳跃式扩散的，是由商船经伏尔加河系引入到加拿大劳伦湖的［19］。在对大量外来入侵种的群体扩散研究中发现外来种的大部分扩散是以长距离跳跃扩散而非渐进式扩散［20］。本文研究海州湾三疣梭子蟹养殖群体与野生群体间Fst间于0.1085—0.1448间，说明处于中度分化状态，Nm处于1.5—2.0间，而野生群体与养殖群体的遗传分化要较养殖群体内部之间更大，基因流也较养殖群体内部之间要小，表明野生群体与养殖群体存在一定的分化，基因流处于中等程度。这一结果其实与作者用AFLP和D－Loop分子标记的对中国沿海6个地理种群结果基本一致，处于中等分化程度［21］。说明野生群体与养殖群体的遗传交流处于中等程度，但养殖群体与野生群体的分化，特别是养殖群体遗传多样性低于野生群体，这也意味着在海州湾开展人工增殖放流是一定要有足够的有效繁殖亲本，且用于放流的三疣梭子蟹应来自当地野生资源。但对中华绒螯蟹，表明人工选育中华绒螯蟹群体与长江水系天然群体间没有发生显著性遗传分化［22］，这在育种来讲是非常理想的。但本研究结果显示出野生和养殖群体三疣梭子蟹的遗传差异，提示了人们要更加注意养殖群体对野生群体的遗传影响。采用线粒体DNA COI基因序列对厚壳贻贝2个养殖群体与2个野生群体的遗传多样性研究显示:在养殖群体中单倍型的数量和遗传多样性要比野生群体的低，养殖群体与当地野生群体之间也未发生显著的遗传分化［23］，这一结果与本研究所得结果一致。总之，三疣梭子蟹养殖群体与野生群体存在的遗传差异，这可能与海州湾人工养殖三疣梭子蟹时间较短、人工放流的规模较小、时间较短有关，短期内的养殖活动和增殖放流活动对海州湾天然三疣梭子蟹群体的遗传影响还十分有限，但这也提示我们进展连续多年跟踪研究的必要性。

4 结论

目前海州湾三疣梭子蟹遗传多样性丰富，与养殖群体的遗传组成存在差异，养殖活动和人工增殖放流对天然资源的遗传影响还很有限，但要适时监测二者的遗传状况，以防止天然基因库受到养殖群体及人工增殖放流群体的干扰与污染;同时，建议增殖放流亲本要选择海州湾海捕的经过遗传评价的群体来进行繁殖放流，以避免对天然三疣梭子蟹遗传资源造成影响。

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