张 晓，李秀玲，李新岗，杨立军，陈 辉

(西北农林科技大学林学院/国家林业局黄土高原重点实验室，杨凌 712100)

松果梢斑螟(Dioryctria pryeri Ragonot)和油松球果小卷蛾(Gravitarmata margarotana(Heinemann))是我国松属针叶树重要的球果和枝梢害虫，一年一代，以幼虫钻蛀危害，长期以来对我国针叶树的正常生长、自然更新和种子生产造成很大影响［1］。特别是北方油松(Pinus tabuleaformis Mill.)良种基地，受害更为严重［2-3］。由于球果小卷蛾对油松球果的先期危害，引诱松果梢斑螟趋向虫害球果产卵和取食，即诱导负防御［3-5］或诱导敏感性［6］。小卷蛾幼虫危害时间比梢斑螟幼虫早7—10 d，并且小卷蛾幼虫的先期危害诱导了油松球果的直接防御和间接防御［2-4］;如显著增加了蛋白酶抑制剂(PIs)、多酚氧化酶(PPO)和松脂含量，特别是双萜松脂酸［2-3］。梢斑螟幼虫在油松上，发育快、个体较大、活跃、竞争能力强，可在虫害球果中正常发育［1］。但高含量松脂(松脂酸)球果(如华山松球果)严重影响梢斑螟幼虫的生长与存活，松脂酸也成为梢斑螟幼虫的直接防御物质［1，3，5］。

近年来，关于虫害诱导负防御的研究已经很多，主要是引诱成虫产卵或幼虫取食的报道，并集中在虫害诱导挥发物的引诱方面［6-9］。虫害诱导负防御是植物诱导防御的一种形式［5-6］，不但松果梢斑螟趋向虫害球果，梢斑螟属(Dioryctria)和其它类群的昆虫也都有趋向虫害寄主或组织的习性［6-8］。但趋向虫害寄主取食的害虫，如何克服或适应虫害的诱导防御，可能涉及一些科学问题，如转基因抗虫植物被更严重的害虫适应或克服、诱抗剂应用后引起潜在害虫的严重危害等。Karban和Baldwin认为，虫害寄主(诱导挥发物)暗示着竞争者和天敌的存在、植物营养质量的下降，也代表着潜在寄主的存在［6］。

害虫取食危害与其激发子一起，激活植物防御基因，使植物产生诱导防御物质对付昆虫。但葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOX)是多食性或具强竞争性鳞翅目幼虫下唇腺中抑制植物诱导防御的“激发子”，可抑制植物的防御，提高害虫自身的适应性［6，10-18］。采用分光光度计法可测定昆虫下唇腺GOX活性［18-20］，且同一昆虫不同寄主组织或不同质量的饲料对昆虫GOX活性影响很大［14，18-19］。据生长率理论，昆虫的生长率和虫体RNA含量与P含量高度耦合［21］，测定同一龄期不同组织梢斑螟幼虫RNA和P含量［21-22］，就可反映取食组织对梢斑螟幼虫生长发育的影响。为了进一步探讨小卷蛾危害引起油松球果的负防御机制，以及梢斑螟幼虫对寄主防御的适应和抑制作用［3］，本文研究了不同组织梢斑螟幼虫GOX活性和虫害组织中的萜类防御物质变化，以及不同组织中梢斑螟幼虫的RNA和P含量。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 材料来源

油松球果和新梢采自甘肃省正宁县中湾油松良种基地，位于子午岭西部，海拔1300—1500 m，1983—1985 年营建，树龄30a，树高约6 m，405 株/hm2，郁闭度0.5—0.6，坡度10—20°。采样时间为2009 和2010 年5月，正是松果梢斑螟幼虫的危害期，通过田间接虫标记，并选择虫害第1天、第5天、第10天和第15天(分别为3、4、5龄和老熟幼虫)的球果和新梢，以健康球果和新梢为对照，每个处理3个重复。球果的取样部位为2年生球果的鳞片，分别从蛀孔左侧、右侧及后方取样;新梢的取样部位为当年生新梢顶部，约2 cm，三分法取样。球果、新稍取样均为 0.3g，置于-80℃用于防御物质的分析［3，23］。

1.1.2 供试昆虫

松果梢斑螟幼虫采样地点和时间同上。采集正在取食球果和新梢的梢斑螟幼虫，每两天采样1次。按取食部位，将其分为危害球果的1果1虫、1果多虫、与小卷蛾共生和危害新梢4个处理。每个处理分别取3龄、4龄和5龄取食活跃期和脱皮期幼虫，以及老熟幼虫各30—60头，共3份材料，置于-80℃分别用于测试幼虫下唇腺GOX活性、RNA和P含量。

1.2 梢斑螟幼虫葡萄糖氧化酶活性测定

1.2.1 幼虫下唇腺提取液的制备

分别解剖1果1虫、1果多虫、与小卷蛾共生和危害新梢4个处理的梢斑螟幼虫，取出下唇腺，在pH 7.0的磷酸缓冲液(0.05 mol/L)中冰浴研磨，4℃ 12000×g离心15 min，取上清液为下唇腺提取液。3龄幼虫每样品中有10头幼虫的下唇腺，其他龄期每样品中有5头幼虫下唇腺，重复6次［13，19］。

1.2.2 下唇腺葡萄糖氧化酶活性测定

GOX活性测定参照Bergmeyer等方法［24］，用UV-1240(uv mini)分光光度计测定。35℃条件下，反应混合物包括:0.17 mmol/L 邻联茴香胺(Sigma)，1.72%D-葡萄糖缓冲溶液(pH 7.0)2.9 mL，60 U/mL 辣根过氧化物酶(Roche)溶液和下唇腺提取液各0.1mL。用0.1 mL缓冲液代替下唇腺提取液为对照。在500 nm下连续记录5 min反应混合物的光吸收，计算每分钟的光吸收变化并作图，取线性变化范围内每分钟变化值。蛋白质浓度测定以牛血清蛋白为标准蛋白，用考马斯亮蓝染色法测定［19，25］。

式中，△A表示线性变化范围内每分钟变化值;N表示酶液总体积;W表示蛋白质含量(mg/mL);T表示光反应时间(min);V表示加入的酶液体积。Ao表示邻联茴香胺在500 nm下的摩尔消光系数，为7.5。

1.3 寄主萜类化合物的提取与分析

1.3.1 萜类成分的提取

根据Miller等的叔丁基甲基醚(TBME)浸提并甲酯化法(简称甲酯化法)，选取0.3g球果或新梢样品，加入1.5 mL叔丁基甲基醚(加150 μg/mL异丁基苯为内标)，震荡浸提14 h，过滤，用0.3 mL 0.1 mol/L的(NH4)2CO3(pH8.0)洗脱，取0.4 mL洗脱后的醚提取物，加0.16 mL甲醇和0.15 mL三甲基硅基重氮甲烷、密封，在室温下放置30 min，再加入0.6 mL洗脱提取物，用装有0.3g硅胶和0.2g无水硫酸镁的巴斯德滴管过滤，用1 mL乙醚洗脱硅胶柱，所得样品置于-20℃冰箱中待分析［23］。

1.3.2 GC-MS 分析

萜类分析利用美国Thermo-Finnigan公司的TraceDSQ气相色谱-质谱仪(GC-MS)，色谱柱利用DB-WAX毛细管柱(30 m×0.25 mm ID，膜厚0.25 μm)，载气氢气;流速 2 mL/min，FID 温度300℃，进样口温度 220℃，进样1μL，分流比10∶1。起始温度40℃，停留3 min，以3℃/min速率升温至110℃，然后以10℃/min速率升温至180℃，再以15℃/min速率升温至250℃，保留10 min。质谱条件:EI离子源，电离能70ev。各成分通过与谱库(NISTZOOZ版)标准化合物的质谱图核对并分析后，进行定性，根据内标法进行定量［2-4，23］。

1.4 梢斑螟幼虫RNA和P含量测定

1.4.1 RNA 提取和含量测定

采用显微荧光测定法测试RNA含量。取3龄、4龄和5龄取食活跃期幼虫各30头(见1.1.2虫源)，每组虫体的RNA用Trizol Reagent(Invitrogen)提取。RNA含量测定以酵母RNA为标准，采用对RNA有高度特异性的荧光试剂Ribo-Green测定。具体方法(Ribo Green RNA quantitation reagent and Minicell Adaptor Kit(P/N 3800-928))为:将RNA样品用TE稀释后取1 mL与等体积1∶2000稀释的RiboGreen试剂混匀，黑暗中放置5 min后在激发和发射波长分别为500 nm和525 nm条件下测定并记录。所有RNA的含量均为占虫体干重的百分比［21］。

1.4.2 P 含量测定

标准曲线的制作:取磷酸二氢钾0.4407g配置标准品溶液(每1mL含磷10.05μg)。取标准品溶液0、0.3、0.6、0.9、1.2 和 1.5 mL 分别置试管中，各加水至 3 mL，摇匀;再分别加入定磷试剂(2.5% 钼酸铵溶液∶3 mol/L 硫酸溶液∶水∶10%抗坏血酸=1∶1∶2∶1，用前配制)3 mL，摇匀;在 50℃水浴中反应 25 min。以0 号管作为空白对照，用UV-1240(uv mini)分光光度计在650 nm测定各样品液的吸光度。以溶液吸光度对其浓度作图，得标准曲线。

P含量的测定:采用抗坏血酸-钼蓝显色定磷法测定虫体中总P含量。取3龄、4龄和5龄取食活跃期幼虫各30头，将虫体在50℃烘48 h后经浓硫酸、浓硝酸硝化。样品溶液与定磷试剂混合摇匀，测定样品溶液的吸光度。利用磷标准曲线计算总磷含量，样品P含量为其占虫体干重的百分比［21-22］。

1.5 数据统计

数据用SPSS 10.0单因素方差(ANOVA)分析样品间的差异显著性，用a、b表示差异显著(P＜0.05);用A、B表示差异极显著(P＜0.01)。采用Sigmaplot 10.0作图。

2 结果与分析

2.1 松果梢斑螟下唇腺葡萄糖氧化酶活性变化

图1为不同组织中松果梢斑螟幼虫下唇腺GOX活性。可以看出，幼虫发育期内GOX活性呈动态变化，1果1虫、1果多虫、与小卷蛾共生和新梢4个处理梢斑螟幼虫GOX活性随虫龄而增加，有相同的变化趋势。但在幼虫脱皮期(每龄第4天)酶活性较低，取食活跃期(每龄第2天)酶活性显著增加。3龄、4龄和5龄取食活跃期GOX活性依次极显著升高(P＜0.001)，在5龄取食活跃期GOX活性最高，老熟幼虫GOX活性最低。

新梢、1果1虫、1果多虫、与小卷蛾共生等不同部位，其同一龄期梢斑螟幼虫GOX活性不同。3龄幼虫中，与小卷蛾共生的幼虫酶活性 ＞1果1虫和1果多虫的幼虫酶活性 ＞取食新梢的幼虫酶活性，但差异不显著。4龄幼虫中，与小卷蛾共生的幼虫酶活性最高(0.62±0.04)，取食新梢的幼虫酶活性最低(0.42±0.08)，取食球果(1果1虫和1果多虫)居中，三者差异显著。但1果多虫(0.50±0.02)和1果1虫(0.55±0.05)的幼虫酶活性差异不显著。5龄幼虫中，与小卷蛾共生的幼虫酶活性最高(0.81±0.07)，显著高于新梢(0.57±0.05)，其余之间差异不显著。

2.2 虫害球果和新梢萜类含量的变化

图2为虫害油松球果和新梢单萜、倍半萜和双萜含量变化。可以看出，单萜、倍半萜和双萜含量呈现先增加后降低的趋势，球果的萜类含量随虫害时间延长而明显下降。虫害1 d时，新梢和球果单萜总含量均显著增加(P＜0.01)，随虫害时间而逐渐降低，虫害15 d时，单萜含量最低。作为新梢和球果单萜主要成分的1R-α-蒎烯和D-柠檬烯含量与单萜总含量有一致的变化趋势，即虫害后先升后降，最后与对照水平接近(图1，表1，表2)。

表1 虫害油松球果主要单萜成分含量随时间的变化/(mg/g鲜重)Table 1 Changes of major monoterpene content with time in the infested cones

图1 不同组织中梢斑螟幼虫下唇腺葡萄糖氧化酶活性比较Fig.1 Glucose oxidase(GOX)activity in labial salivary glands of D.pryeri developed in four host tissues

油松球果和新梢中倍半萜含量较少，虫害后倍半萜含量明显下降。虫害初期，球果中倍半萜含量没有变化，随后显著下降;而新梢虫害初期倍半萜含量略有增加，随后明显下降。倍半萜总含量，球果略高于新梢(图1)。球果和新梢中主要倍半萜均为石竹烯、α-石竹烯和1-甲基-5-亚甲基-8-(1-异丙基)-1，6-环十二烯，其中石竹烯含量较大。在虫害球果，初期(第1天)石竹烯增加，随后显著下降;而其它2种成分虫害后显著降低(表3)。虫害后，新梢中的石竹烯显著增加，随后呈曲线波动;α-石竹烯虫害后显著增加，随后降低;1-甲基-5-亚甲基-8-(1-异丙基)-1，6-环十二烯在虫害初期含量变化不大，但在虫害10 d后，该成分检测不到(表4)。

表2 虫害新梢主要单萜成分随时间的变化/(mg/g鲜重)Table 2 Changes of major monoterpene content with time in the infested branches

图2 松果梢斑螟幼虫危害后油松球果及新梢萜类含量随时间的变化Fig.2 Changes of terpene content with time in fested cones and branches

表3 虫害球果主要倍半萜成分随时间的变化/(mg/g鲜重)Table 3 Changes of major sesquiterpene content with time in the infested cones

图2可以看出，球果虫害后，双萜含量显著增加，后期明显降低到正常水平。虫害第1天双萜含量达到最大(7.993 mg/g鲜重)，是健康球果的1.7倍;虫害5 d时双萜含量是健康球果的1.4倍，第10天双萜含量开始下降，第15天时接近健康球果水平。新梢虫害后，其双萜含量初期显著增加，随后逐渐接近健康新梢，但虫害第15天时双萜含量又显著高于健康新梢(图1)。虫害球果和新梢显著增加双萜成分是松香酸甲酯、1-菲羧酸甲酯类和贝壳杉-16-烯-18-酸酯，新梢中松香酸甲酯含量较少。双萜主要成分的变化趋势与总含量一致:虫害后显著增加，后逐渐降低(表5，表6)。

表4 虫害新梢主要倍半萜成分随时间的变化/(mg/g鲜重)Table 4 Changes of major sesquiterpene content with time in the infested branches

表5 虫害球果主要双萜成分随时间的变化/(mg/g鲜重)Table 5 Changes of major diterpene content with time in the infested cones

表6 虫害诱导新梢主要双萜成分随时间的变化/(mg/g鲜重)Table 6 Changes of major diterpene content with time in the infested branches

2.3 取食寄主不同部位对梢斑螟幼虫RNA和P含量的影响

根据生长率和虫体RNA与P含量高度耦合的理论［21］，测定取食不同处理食物的梢斑螟幼虫RNA与P含量，可间接反映寄主食料对幼虫生长发育的影响。表7可以看出，取食3种不同处理寄主食物的梢斑螟幼虫，都以3龄幼虫的RNA含量和P含量最高，其次是4龄幼虫和5龄幼虫，差异极显著(P＜0.01)。说明梢斑螟3龄幼虫的生长率较快，之后逐渐变缓。

就取食部位来看，3个龄期幼虫RNA含量均为:取食新梢幼虫 ＜取食小卷蛾危害球果幼虫＜取食球果(1果1虫和1果多虫)幼虫，但无显著差异。就P含量来看，除4龄幼虫外，取食球果的梢斑螟幼虫P含量较高，取食新梢的幼虫P含量较低，差异不显著。说明3种处理食物对梢斑螟幼虫生长率影响无显著差异。

表7 取食寄主不同部位梢斑螟幼虫RNA和P含量比较Table 7 RNA and P content comparison of pine comeworm larvae in different host tissue

3 讨论

在北方油松良种基地，每年7月，羽化的松果梢斑螟成虫趋向虫害(干枯的)球果附近产卵;翌年5月，小卷蛾幼虫先期危害，引诱梢斑螟越冬幼虫趋向正在发育的虫害球果;同时，梢斑螟幼虫也危害健康球果和新梢［1-2，4］。在林区条件下，本研究选择梢斑螟与小卷蛾一起危害(与小卷蛾共生)的球果、有1头梢斑螟幼虫(1果1虫)的球果、有2—3头梢斑螟幼虫(1果多虫)的球果和梢斑螟危害新梢等4种处理，取食不同食料的梢斑螟幼虫下唇腺GOX活性测试表明，4种食料均以5龄幼虫GOX活性最高，显著高于4龄和3龄幼虫。并且，3个龄期的幼虫均表现为:球果中与小卷蛾共生的梢斑螟幼虫GOX活性 ＞球果中单一梢斑螟幼虫酶活性＞新梢中幼虫酶活性，其中与小卷蛾共生的4龄和5龄幼虫GOX活性显著高于新梢内的幼虫。研究发现，多食性鳞翅目幼虫下唇腺GOX可显著抑制植物的防御。并且，人工饲料饲养的幼虫GOX活性显著高于寄主植物上发育的幼虫，同一昆虫不同寄主上幼虫GOX活性也显著不同，反映了食料质量(碳水化合物、蛋白等)影响幼虫GOX活性水平［14，18-19］，这与本研究结果一致。

双萜(松脂酸)是针叶树组成和诱导防御的主要物质，可作为植食性昆虫的有毒成分而起到直接防御作用［26-28］。松脂萜类聚集在针叶树特化的松脂道中，虫害引起松脂道受损，伴有单萜挥发物的松脂在受害部位形成物理和化学障碍。而倍半萜在松脂中所占比例较小［5，28］。本研究结果显示，双萜(松脂酸)的基础量最大(5.0 mg/g 鲜重左右)，而倍半萜则很少(0.3—0.5 mg/g 鲜重)，单萜在1.5 mg/g 鲜重左右;虫害后，松脂酸变化在±2.5 mg/g鲜重，虫害球果随时间逐渐减少，第10天后低于2.7 mg/g鲜重;而新梢虫害后，松脂酸初期显著增加，随后降低，最后显著高于健康梢。虫害后，单萜的情况类似双萜，而倍半萜在虫害球果和新梢中，总体是逐渐减少的。与球果比较，新梢的防御物质(松脂酸)逐渐增加。以前研究中，比较了油松球果小卷蛾幼虫危害后，虫害球果萜类的变化，以及其它防御物质的增加［2-3］，在本研究中没有比较2种害虫危害油松球果防御反应的差异。

与小卷蛾共生、油松球果和新梢3种食料的梢斑螟幼虫RNA和P含量显示，3龄幼虫RNA和P含量最高，随后逐渐减少，差异极显著，说明前期幼虫发育快，后期幼虫发育慢，符合生长率与虫体RNA和P含量高度耦合的生长率理论［21］。在3种食料中，3个龄期幼虫RNA和P含量与食料密切相关，但3种食料间幼虫RNA和P含量(即生长率)无显著差异，说明梢斑螟幼虫可通过GOX调节和抑制植物的防御［10-15，18-20］。但3种食料对梢斑螟存活、蛹重和生殖的影响还不清楚［19］。下唇腺GOX的高抑制作用是多食性鳞翅目幼虫应对寄主诱导防御的对策［18］，而GOX及其产物H2O2通过激发水杨酸(SA)途径而抑制茉莉酸-乙烯(JA-ET)调控的植物防御，改变了植物基因表达，所以GOX能抑制寄主的直接和间接防御［12，20］。小卷蛾幼虫的先期危害，激发了JA途径调控的诱导防御，降低了食物质量［3，5］，但后来的梢斑螟幼虫用GOX抑制松脂酸等防御物质［20］，使其生长率与健康球果、新梢中的幼虫基本一致。

油松球果小卷蛾幼虫的先期危害，引诱梢斑螟越冬幼虫趋向球果取食［2］，造成2种害虫对食料的竞争。在竞争中，小卷蛾幼虫处于劣势而部分死亡，梢斑螟幼虫的死亡率却很低［1］。但是，由于小卷蛾幼虫提前脱果下地，通过虫害球果挥发物(间接防御)而引诱寄生蜂，使受害球果内的梢斑螟幼虫寄生率提高，说明趋向受害球果的梢斑螟幼虫，面临着天敌的威胁［1-2，6］。球果受害后，抗营养、抗消化酶类和防御物质增加，营养质量下降［2-3］，但本研究表明，梢斑螟幼虫通过GOX活性抑制植物的防御，使不同食料的幼虫生长率基本一致。后来羽化的梢斑螟成虫，通过虫害挥发物，趋向虫害球果附近产卵［4］。进一步证明，虫害寄主(诱导挥发物)暗示着竞争者和天敌的存在，寄主营养质量的下降，也代表着潜在寄主的存在［6］，说明后来者具有特殊的克服机制。

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