李小多，李学刚，张 波，宋尚华，刘旭晶，叶小利，*

(1.西南大学生命科学学院，重庆400715;2.西南大学药学院，重庆400716)

血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)在肾素-血管紧张素系统中具有调控血压的重要作用［1］，主要催化血管紧张素Ⅰ转化为具有较强升压作用的血管紧张素Ⅱ［2］。目前市场上降压效果较好的卡托普利(caporal)，依那普利(enalapril)等［3］大多是合成药物，长期服用都会有不同程度的副作用，如咳嗽、心血管疾病、皮疹、血管性水肿等［4］。我国中药资源丰富，且有悠久的用药历史，筛选对ACE具有强抑制活性的中药对降压药物的开发具有重要的意义。本实验采用体外模型［5］，以马尿酰-组氨酰-亮氨酸(Hip-His-Leu，HHL)为ACE反应底物，产物马尿酸(HIP)为测定指标，HIP的生成量与ACE的活性正相关。以ACE为靶点，用高效液相色谱法(HPLC)［6］测定了32味中药提取物和活性部位对ACE的抑制作用，筛选出了枸杞以及枸杞提取物的降压活性部位，并对枸杞活性部位进行纯化。目前对枸杞以ACE为靶点研究其降血压功能尚未见报道，因此，本研究结果为枸杞降血压的研究及相关药品开发奠定了一定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

兔肺 中国人民解放军第三军医大学;叶黄素、山茱萸、丹皮、天花粉、首乌、黄芩、白芍、沙参、木香、菟丝子、桑叶、女贞子、茯苓、玄参、山药、熟地黄、玉竹、天门冬、太子参、桔梗、麦冬、菊花、淫羊藿、人参、泽泻、决明子、知母、山楂、五味子、黄芪、佛手、枸杞

购于重庆市安康大药店;HIP、HHL Sigma公司;东莨菪苷 上海源叶生物科技有限公司;甲醇为色谱纯 天津市科密欧化学试剂有限公司;其他试剂均为分析级。

LC-20AD型高效液相色谱仪 日本岛津;RRH-250型万能高速粉碎机 欧凯莱芙宝业公司;KQ5200DA型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;pH5-3C+型酸度计 四川成都方舟科技有限公司;Avanti J-30i高速冷冻离心机 美国Beckman;HHW-21CU-600恒温水浴锅 上海福玛实验设备有限公司;TG16-W微量高速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 色谱条件

色谱柱:ODS-BP(4.6mm ×200mm，5μm)，流动相为甲醇-0.1%三氟乙酸水溶液(25∶75，v/v);检测波长 228nm，流速 1.0mL/min，柱温 37℃，进样量 20μL［2］。

1.3 ACE粗酶的制备

根据文献［7-8］方法，加以改进，所有操作均在冰水混合物中进行。兔肺用0.9%NaCl漂洗至洗液无血红色，剪至碎块，4℃冷藏过夜，兔肺与硼酸盐缓冲液(SSB，0.1mol/L，p H8.3)固液比(g∶mL)1∶5 混合，转入组织匀浆机中，间歇匀浆(每匀浆20s放入冰箱冷冻30s，反复3次)，4℃冷藏6h使浸提物充分溶出。在4℃、700×g离心20min，弃沉淀，上清液在4℃、37000×g离心1h，上清液即为ACE粗酶，-20℃储存备用。

1.4 ACE的活性检测

根据文献［9］的方法，适当改进，设计ACE粗酶体积分别为 10、20、40、60、80μL，加入 SSB、HHL 和ACE 总体积 200μL，37℃ 孵化 40min，加入 300μL 1mol/L HCl溶液终止反应，10000r/min离心10min，HPLC检测HIP峰面积。

1.5 中药提取物的制备

中药材粉碎，过100目筛，称取各药材2.0g，加入体积分数为75%的乙醇提取，料液比(g∶mL)1∶10，常温超声(100W，20kHz)提取30min，即为中药提取物，浓度为0.1g/mL，4℃保存备用。

1.6 枸杞活性部位的分离及成分的鉴别

1.6.1 枸杞大孔树脂活性部位的制备 枸杞60℃烘干至恒重，粉碎后过100目筛，石油醚脱脂、脱色素1h［10-11］，体积分数为 75% 的乙醇，料液比(g∶mL)1∶16，75℃回流提取 2h，残渣重复提取 1次，合并提取液，75℃浓缩至恒重。浸膏过D-101大孔树脂，用水、不同体积分数的乙醇(25%、50%、75%、95%)梯度洗脱，洗脱液分别浓缩烘干成浸膏待用。

1.6.2 枸杞硅胶活性部位的制备 将枸杞大孔树脂抑制率最高的部位60℃烘至恒重，与硅胶(100～200目)质量比1∶1拌样烘干，按质量比1∶50装柱，然后用不同体积比的乙酸乙酯/甲醇作为洗脱剂梯度(9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5，纯甲醇和 0.2% 醋酸甲醇)洗脱得 A、B、C、D、E、F、G 七个部位。分别浓缩烘干成浸膏待用。

1.6.3 ACE抑制成分的分离及鉴别 将枸杞硅胶抑制率最高的部位60℃烘至恒重，用硅胶(200～300目)柱进一步分离纯化，得到两个化合物，以薄层色谱(TLC)进行定性分析，经核磁(1H-NMR，13C-NMR)鉴定，最终推测枸杞中抑制ACE的主要活性成分。

1.7 供试品溶液的制备

加样量及顺序如表1，37℃温浴5min后，加入20μL的ACE粗酶启动反应，37℃孵化40min，加入300μL 1mol/L HCl溶液终止反应，反应总体积为500μL，10000r/min离心10min，HPLC 检测 HIP 峰面积(S)。药物抑制率按下式计算:

抑制率 I(%)=(S对照-S药物)/(S对照-S空白)×100 ACE抑制剂活性用 IC50值表示。IC50为抑制剂对ACE抑制率达到50%时抑制剂的量。

表1 ACE反应体系(μL)Table 1 ACE reaction system(μL)

2 结果与讨论

2.1 ACE的活性检测

由图1可以看出，酶蛋白的体积和HIP峰面积之间有良好的线性关系，说明此法可以精确检测ACE的活性，能够反映酶与底物的反应程度，从而确定酶的合适剂量。

图1 HIP峰面积与ACE体积变化的关系曲线Fig.1 Relation curve of HIP peak area with ACE volume

2.2 不同中药提取物对ACE的抑制作用

本实验将中药提取物分别配成10、20、40mg/mL 3个浓度，且3个浓度的实验结果呈很好的线性关系，表2是20mg/mL药物浓度的实验数据。由表2可知，32味药材中，叶黄素、山茱萸、丹皮、天花粉、首乌、黄芩、白芍、沙参、木香、菟丝子对ACE没有抑制作用;其他药物对ACE都有一定的抑制作用，泽泻、决明子、知母、山楂、五味子、黄芪、佛手、枸杞对ACE的抑制率都高于60%，其中枸杞的抑制率最高，达到92.30%，说明枸杞中含有能有效抑制ACE的活性成分。因此，选取枸杞进行下一步的研究。HIP标准品、阴性对照及枸杞提取物反应液HPLC图见图2。由图2(B)可知，阳性对照体系(SSB+HHL+ACE)反映了ACE具有很高的活性;由图2(C)可知，枸杞反应液体(SSB+HHL+ACE+枸杞提取物)当加入抑制剂时，HIP生成量明显减少，ACE活性受到抑制。

表2 药物对ACE的抑制率(%)Table 2 ACE inhibitor rate of traditional Chinese medicines(%)

图2 HIP对照品(A)、阴性对照(B)、枸杞提取物反应液(C)的HPLC图Fig.2 HPLCchromatograms of HIPreference substances(A)，negative sample(B)，and reaction liquid of Lycium barbarum L.extracts(C)

2.3 枸杞的大孔树脂活性部位对ACE的抑制率

枸杞提取物总浸膏以及总浸膏经D-101大孔树脂后得到未吸附、水洗脱及25%、50%、75%、95%乙醇洗脱的6个活性部位，浓缩蒸干，配成浓度为0.1mg/mL的溶液。经HPLC法分别检测各部位对ACE活性的抑制作用，各部位对ACE活性的抑制率如表3，由表3可知，水洗脱部位、95%的乙醇洗脱部位对ACE的抑制作用较小。总浸膏、未被大孔树脂吸附的部位、25%、50%、75%乙醇洗脱部位对ACE活性均有抑制作用，其中50%乙醇部位的抑制率最高，抑制率为35.46%。因此，选取50%乙醇部位进一步纯化。

表3 大孔树脂活性部位对ACE的抑制率Table 3 ACE inhibitor rate of eluted fractions from D-101 macroporous adsorption resins

2.4 枸杞的硅胶活性部位对ACE的抑制率

枸杞大孔树脂的50%洗脱部位经硅胶柱吸附，根据1.6.2得到的 A、B、C、D、E、F和 G 7个活性部位，浓缩蒸干，配成浓度为0.1mg/mL的溶液。经HPLC分别检测各部位对ACE活性的抑制作用，各部位对ACE的抑制率如表4。由表4可知，G洗脱部位对ACE无抑制作用;其它的活性部位对ACE活性均有抑制作用，其中D洗脱部位的抑制率最高，达到56.26%。

表4 枸杞活性部位对ACE的抑制率Table 4 ACE inhibitor rate of eluted fractions from silica gel

2.5 枸杞的活性成分对ACE的抑制率及鉴别

将枸杞硅胶洗脱的D部位用硅胶进一步分离纯化，并对得到的化合物1和2进行ACE活性测定，由表5可见，化合物1的抑制率为96.67%，而化合物2的抑制率为26.56%，所以可以初步断定枸杞中抑制ACE活性物质是化合物1。化合物1的核磁波谱数据为:紫外灯(365nm)下显强蓝色荧光。1H-NMR(500Hz，CD3OD)δ:7.89(1H，d，J=9.5Hz，H-4)，7.34(1H，s，H-5)，7.20(1H，s，H-8)，6.29(1H，d，J=9.5Hz，H-3)，3.90(1H，s，OCH3)，5.11(2H，d，J=3.5Hz)，3.18～3.69(多重峰);13C-NMR(500Hz，CDCl3)δ:163.8(C-2)，114.6(C-3)，144.7(C-4)，110.7(C-5)，148.1(C-6)，151.7(C-7，C-8a)，103.6(C-8)，113.1(C-4a)，57.1(OCH3)，60～80 之间碳的个数和其化学位移显示包含单糖信号［12-13］，特征峰与东莨菪苷对照品基本一致［14］，从其波谱数据可以确定化合物1是一种东莨菪糖苷类物质。化合物2核磁波谱数据为:紫外灯(365nm)下显强蓝色荧光，黄色针状结晶(CHCl3)。1H-NMR(500Hz，CDCl3)δ:7.59(1H，d，J=9.5Hz，H-4)，6.92(1H，s，H-5)，6.85(1H，s，H-8)，6.26(1H，d，J=9.5Hz，H-3)，3.96(1H，s，OCH3);13C-NMR(500Hz，CDCl3)δ:113.5(C-3)，143.2(C-4)，107.2(C-5)，149.8(C-6)，150.2(C-7，C-8a)，103.2(C-8)，111.5(C-4a)，56.3(OCH3)。通过与文献［15-16］对照，将化合物2鉴定为莨菪亭(scopoletin)，化合物1和2为同系物。推测枸杞中抑制ACE活性的主要成分可能是香豆素类化合物中的一种东莨菪糖苷类物质。

3 结论

表5 化合物对ACE的抑制率Table 5 ACE inhibitor rate of compound

3.1 血管紧张素转化酶(ACE)的活性与血压的高低直接正相关，有效的抑制ACE的活性，就能在高血压的治疗中取得显著的效果。因此，筛选能有效抑制ACE活性的中药具有重要意义。本实验用HPLC测定了32味中药对ACE活性的抑制情况，结果表明，泽泻、决明子、知母、山楂、五味子、黄芪、佛手、枸杞对ACE均有一定抑制，其中枸杞的效果最好，为进一步研究和开发枸杞作为降血压药物奠定了基础。对ACE无抑制作用的药物可能是其降压机制不是以ACE为靶点，而是通过其他途径使血压降低，或者这些药物本身无降压作用，这个问题有待进一步研究。

3.2 目前对枸杞以ACE为靶点研究其降血压功能的研究尚未见报道。本实验通过对枸杞乙醇提取液进行大孔树脂吸附，以乙醇梯度洗脱，经HPLC测定了枸杞各部位对ACE的抑制作用。实验结果表明，50%的乙醇洗脱液对ACE有最强抑制作用。乙醇体积分数过低有效成分未能充分解吸附，而乙醇体积分数过高会把色素等杂质冲洗下来，从而影响有效成分的富集，所以50%的乙醇对于抑制ACE酶的有效成分的解吸附最适宜。对50%的乙醇部位用硅胶进一步纯化，结果发现D洗脱部位对ACE的抑制率达到56.26%，说明硅胶能有效的纯化枸杞中对ACE有抑制效果的活性物质。通过对D洗脱部位进一步的分离纯化，结果得到两个化合物，东莨菪糖苷类化合物的抑制率为96.67%，莨菪亭的抑制率为26.56%，通过核磁鉴定，推测枸杞中抑制ACE活性的主要物质可能为香豆素类化合物中的一种东莨菪糖苷类物质。本实验结果丰富了枸杞的药用价值，开辟了枸杞降血压的新途径;但抑制ACE活性的具体成分、化学结构和作用机制有待进一步研究。

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