施文骁，王洪凯，郭庆元

(1.浙江大学农业与生物技术学院生物技术研究所，浙江杭州 310058;2.新疆农业大学农学院，新疆乌鲁木齐 830052)

葡萄根癌病是温带葡萄种植区的一个极具破坏性、毁灭性的病害，由细菌侵染引起，可在葡萄藤上存活并繁殖，并能引起葡萄产量的下降，甚至导致葡萄藤的枯死［1］。早期对欧洲或美国的葡萄根癌病的描述和报道都来自Hedgecock［2］。但在1897年，Cavara［3］首次证明，造成意大利葡萄根癌病的病原是一种传染性细菌 (Bacillus ampelopsorae)。1907年，Smith等［4］在美国首次从巴黎的菊花上分离到了根癌病病原菌，研究发现，将病原菌接种到多种植物上，均能表现出致瘤性。1948年，Braun和Mandle通过试验证明了Agrobacterium tumefaciens的致病因子的存在;1973年，Panagopoulos和Psallidas比较了分离自葡萄和来源于其他植物的根癌农杆菌的菌株，证明了侵染葡萄的菌株与其他根癌农杆菌的菌株在遗传上有明显差别。到1990年，Ophel和Kerr将侵染葡萄的根癌农杆菌的菌株定为一个新种 Agrobacterium vitis。虽也有报道 A．rhizogenes可引起葡萄根癌病，且来自分子和脂肪酸的研究表明，A．vitis和A．rhizogenes的亲缘关系很近，但大量试验确认，葡萄根癌病的主要的病原菌是 Agrobacterium vitis［5-6］。

1 葡萄根癌病的症状及侵染循环

1.1 症状

葡萄根癌病主要症状是形成葡萄根部的癌肿。病原菌可在伤口侵入植物体内，进而导致植物细胞产生过量的植物生长激素，从而生成根瘤或其他次生增大。可存在于易感染的植物组织和根部，也可在枝条等部位也会产生癌肿。当其存在于植物根部时，可破坏植物根冠对水和矿物元素的吸收，导致植物生长不良。此外，病害还会侵染葡萄植株的形成层和维管组织，影响营养的运输和葡萄藤的健康。葡萄根癌病会使葡萄逐渐枯梢，严重时可导致藤蔓死亡。发病时，树干下部的韧皮部细胞也会因病而亡，导致类似环剥的影响［7］。

1.2 侵染循环

该病的病原菌是一种细菌，主要通过伤口或孔口进入植物体内，引起系统性侵染。受病原菌感染的植物部位可一直保持正常，直至该部位受伤。造成伤口的原因很多，如冷冻损伤、移植栽培、修剪维护等原因是造成葡萄发病的重要诱因。农事措施如藤条嫁接、抹芽等也会造成伤口，从而被病原菌侵染而存在病症。

葡萄根癌病的初次发病通常在初夏。根癌病的侵染分为3个步骤。首先是病原体进入植物的非原质体部位。葡萄土壤杆菌会特别集中在葡萄的根际，且一般通过根和地下伤口部位进行侵染［8-9］。第2步为细菌在木质部的定殖。葡萄土壤杆菌系统地定殖在葡萄植株上，并通过木质部的液流散布到植株的各个部位［10-11］。第3步包括了对植物反应的逃避以及对植物防卫机制的抑制。例如，细菌的katA基因编码的过氧化氢酶可降解植物所产生的过氧化氢［12-13］。根据侵染部位和发病条件的不同，病害迅速发展时，癌肿在一个生长季即可环绕葡萄藤一圈，而发展缓慢时，这个过程则需要几年。当秋天来临时，癌肿会变得干燥、暗黑色并坏死。

葡萄根癌病的病原菌平时存在于葡萄周围的土壤中，可在葡萄的根部越冬。病原菌通过感染地下根冠及受伤部分，入侵到植物体内并通过维管束感染植物其他部位的细胞。随后，冠瘿、根癌会在植物生长的过程中逐步形成。随着枯死的茎与藤的掉落与转移，病原菌也随之转移。在土壤中至少生活2年以上。随着葡萄植株上新的伤口的产生，从而侵染其他的葡萄植株。

2 病原菌的致病机制

葡萄根癌病菌可在葡萄植株的根部定殖，并通过维管束散布到整株植株，同时可自主逃避植物的防御反应。Agrobacterium vitis拥有大量的Ti和Ri质粒，这些质粒上编码的蛋白是致病因子的来源。T-DNA可进入植物细胞的核基因，进而表达TDNA编码植物激素形成的酶［14］。

2.1 T-DNA侵入到植物细胞

葡萄根癌病菌从伤口侵染的过程中，随着寄主伤口的愈合，完成T-DNA的转化，之后随寄主细胞的分裂出现症状。在葡萄生产管理过程中，或自然逆境下，如嫁接导管连接的发展和嫁接时的组织修复和重建，冻害以及葡萄园设备所造成的物理伤害等过程都可造成伤口。这些伤口愈合过程中可形成愈伤组织，而癌肿也随之产生［14-15］。在果园中，肿瘤的生长通常会出现在接穗愈合的周围、植株的下部躯干和扦插去顶的部位，因这些部位都会出现伤口愈合，同时又对T-DNA的侵入高度敏感。

Ti质粒上存在着毒力基因，这些基因表达的蛋白在T-DNA转移中起到重要的作用［15-18］。在这些毒力基因中，VirA和VirG是双组分的检测体系，VirA是传感蛋白，VirG为转录的生长调节剂，VirA在特定的职务酚类物质的作用下引起伤口愈合，VirG能增加所有毒力基因的转录;VirD4和virB的蛋白为转移T-DNA和其他毒力蛋白所必需;VirD2是T-DNA传输过程中的引导蛋白，而VirE2为肿瘤形成所必需［13，19］。

2.2 T-DNA整合到植物核基因上

葡萄根癌病T-DNA转移到植物核基因中诱导癌肿形成的［20］。整合到植物染色体中的细菌 TDNA含有植物生长素和细胞分裂素的基因可导致植物细胞生长素 (吲哚-3-乙酸)和细胞分裂素的高水平表达，2个基因的过量表达会使葡萄藤形成肿瘤［21-22］。

植物生长素需要2个生化途径来合成。第一步是iaaM基因的表达，这诱导了色氨酸单加氧酶的产生。随后色氨酸单加氧酶将色氨酸转化成吲哚乙酰胺。第2步则是iaaH基因表达吲哚乙酰胺的水解酶。随后吲哚乙酰胺水解酶将吲哚乙酰胺转变成植物生长素。植物体内的T-DNA的表达以及激素产生水平的提高打断了常规的细胞循环。这是因为植物细胞不能对T-DNA的表达进行调控。这些反常的植物细胞增殖导致了植物癌肿的生成［13］。

3 葡萄根癌病的防治和检测

3.1 检测

对葡萄根癌病进行快速准确的检测是进行病害防治的前提，也是早期防治预警和预防的基础。当病原菌潜伏在土壤中时，通过各种手段将土壤中的病原菌检测出来，在发病前对其进行根除。

通常对病原菌的鉴定主要是通过PCR的方法，而病原细菌主要进行扩增的基因则是16 S～23 S及其周围序列。但农杆菌的Agrobacterium tumefaciens，Agrobacterium vitis，Agrobacterium rhizogenes 3 个主要的致病种中，其16 S基因的序列很相似。分析IVS在23rRNA基因中的差别发现，其中存在有长和短2种类型，在A.V中有一些的长型和A.T很相似，同时在A.V中有另一些的长型和A.R很相似;有2个A.V菌株中同时含有这2个类型的IVS，且含有A.T和A.R的IVS。这说明在农杆菌的不同种中，基因可进行水平转移并重组。而A.T在这3个种当中的可变度最高，说明通常的检测手段是行不通的。目前研究已发现很多的新引物可用于进行葡萄根癌病的病原菌检测［23-28］。

3.1.1 PCR方法的早期检测

设计一对特异性引物可以对根癌病进行快速检测。根据TMR位点的特异性和敏感性可获得1对检测根癌农杆菌的引物。在测试的细菌中，只有A．tumefaciens可产生236 bp目标片段。特异性PCR系统的敏感性由一个巢式PCR扩增决定，这可控制模板DNA的拷贝数［29］。virD2基因也可作为根癌农杆菌检测的特异性基因，并可通过定量PCR的方法对其进行检测［30］。扩增生物群1根癌农杆菌的T-DNA上的基因5和TMS2之间的243-bp的DNA片段可用来进行葡萄根癌病的检测。这些引物与菌株毒力100%正相关，而与无毒的100%负相关，从而有利于实时 PCR的检测［31］。一个葡萄土壤杆菌特异性DNA片段 (pAVS3)可通过引物URP2R来进行PCR多态性条带的扩增。通过从不同的土壤杆菌属物种的基因组DNA进行Southern杂交证实，该片段在A．vitis中具有特异性。再设计引物，通过巢氏PCR对其进行检测［32］(表1)。因此，通过病原菌上的特异片断可对该病进行早期的检测。

表1 用于PCR检测的特异性引物

3.1.2 电子鼻的检测

所谓的电子鼻是一个能够进行固相微量取样的探头，取样后可以直接与气质色谱分析连用。从而区别健康和感病的葡萄植株。感病的葡萄植株中可以将肉桂酸脱羧成苯乙烯，而正常植株中不含这种气体。通过顶空固相微萃取与气相色谱-质谱法分析目标葡萄植株样品的挥发性物质的特性。主成分分析证实了被感染的葡萄藤和健康的葡萄藤的挥发物质的区别［33］。

3.2 防治方法

3.2.1 普通方法

由于细菌生长在木质部中，所以目前为止没有有效的化学防治方法［7］。防治葡萄根癌病主要在于预防，预防葡萄植株受伤和同时维护健康的藤蔓，除去死亡和生病的组织可减轻病害的发生。

3.2.2 基因工程

现在基因工程的方法在很多领域都得到应用，也包括对葡萄根癌病的防治。

基因工程能辅助葡萄育种，产生抗病和抗逆的葡萄。目前全球对葡萄需求的增加促使了这门科学的快速发展。将外源基因转化葡萄并进行表达，从而使葡萄获得抗逆性和抗病性。例如抑制病原菌的转基因植物表达抗菌肽。尽管转基因植物的抗逆性并不是很强，但相比非转基因的防治，MAG-2或MSI99基因表达使得癌肿的发病率下降［24］。

将葡萄根瘤农杆菌的致病基因突变后转入葡萄植株中，可提高对根癌农杆菌的抗性［25］。根据几个以前的嵌入T-DNA的VirE2输出整合阻碍理论研究显示，抗性提高是因为突变的VirE2蛋白和功能的VirE2蛋白的竞争的联系。在植物细胞内，竞争的出现阻碍了T-DNA进入整合到植物细胞核中［15-18］。

3.2.3 生物防治

生物控制是防治葡萄根癌病最有效的方法之一，采用非致病细菌菌株接种到葡萄植株及其生长的土壤中，从而达到减轻或防止根癌农杆菌为害［26］。

目前已有20多个生防菌株用于防治葡萄根癌病。放线菌株产生的K84就是生物防治的一个代表，但k84并不能完全成功的控制住葡萄根癌病。Rahnella aquatilis(水生拉恩氏菌)的菌株HX2可对葡萄根癌病进行生物防治，抑菌的主因是产生了一种抗菌物质，它与其他菌株相比能产生较大的抑菌圈及较低的最低抑菌浓度，能抑制Agrobacterium vitis中RNA和蛋白质的合成。有多种非致病的农杆菌亦可对葡萄根癌病进行生物防治［13，27］。

4 小结

随着生活水平的提高，人们对农产品安全和环境要求更高，葡萄根癌病的防治引起人们的重视。葡萄根癌病作为土传病害，传统的防治方法防控效果不尽人意。生物防治对环境的影响小，对葡萄产品安全，但无论使用天然菌株的生物控制，或转基因拮抗菌株的生物控制，或利用转基因的葡萄来防止葡萄根癌病，这些方法至今还在进一步研究中。因此，通过基因工程和生物防治方法来选育抗性品种是预防葡萄根癌病发生的有效方法之一。同时开展快速检测方法的研究，可对该病害早期快速准确检测和提早预警，在刚发病甚至未发病时做到发现并消除病原，从而达到有效防控的效果。

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