焦志勇 罗敏 李盛 赵家峰 宁雪莲

人羊水干细胞（human amniotic fluid stem cell，hAFSC）是一类具有胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）增殖分化特性的细胞，通过羊水穿刺获取，具有比ESC易获取、较强复制增殖能力和分化能力、可避免伦理问题等诸多独特的优势[1-3]。肝细胞生长因子（heparoocyte growth factor，HGF），又称扩散因子（scatter factor，SF），是骨髓微环境分泌的主要细胞因子之一。国内外研究证实骨髓间充质干细胞（bone-marrow mesenchymal stem cell，BMSC）能表达HGF受体c-Met，HGF对MSC具有很强的趋化作用[4-5]。而HGF对于羊水干细胞的作用尚不清楚。本研究在体外成功分离培养及鉴定羊水干细胞，并观察HGF对羊水干细胞迁移黏附的影响。

材料和方法

一、材料

低 糖 DMEM（美 国 Hyclone公 司），胎 牛血清（以色列 Bioind公司），0.05﹪胰蛋白酶EDTA（美 国 Invitrogen 公 司），兔 抗 人 Oct-4、c-kit、SSEA-1、CD105抗体（英国 Abcam 公司），rhodamine及FITC标记小鼠源二抗（Proteinch Group公司），HGF因子（美国BD公司），微孔隔离小室（Transwell）24孔板（美国 Corning costar公司）。

二、方法

1.hAFSC的培养：20例羊水标本均采自18～24周孕妇，并在采集前均获得孕妇本人的知情同意。本研究获得南华大学附属第二医院伦理委员会批准。孕妇在B超定位后常规消毒，穿刺抽取羊水约20ml。1300 rpm离心10min，弃上清后保留0.5ml羊水，重悬细胞，接种于25 cm2培养瓶中，加入低糖DEME培养基，培养基中包含100 U/ml青霉素及链霉素、10 ng/ml表皮生长因子、18﹪的胎牛血清。37 ℃、5﹪CO2培养箱培养7 d，换液，以后1周换液2次。当细胞融合80﹪时，0.25﹪胰蛋白酶EDTA消化，加入新鲜培养液重悬细胞，按1:3的比例传代，继续培养，每3天换液1次。hAFSC传至第3代，收集细胞用于实验。

2.细胞免疫荧光鉴定hAFSC：第3代的hAFSC生长至80﹪融合时，0.25﹪胰蛋白酶消化细胞，接种于盖玻片，多聚甲醛固定30min，PBS洗3次，5﹪山羊血清4 ℃封闭10min，分别加小鼠抗人Oct-4、兔抗人SSEA-4一抗，4 ℃孵育过夜，PBS洗细胞3次，加FITC标记小鼠源二抗和rhodamine标记兔源二抗，孵育30min，PBS洗3次后，封片，荧光显微镜下观察拍照。

3.Western blot鉴定hAFSC：收集第3代的hAFSC，加入PAI裂解细胞，离心，取适量蛋白上清，加入适量5×SDS凝胶加样缓冲液，沸水加热变性，冰上冷却。10﹪SDS-PAGE电泳分离并转移至PVDF膜，确定分子量大小。5﹪脱脂牛奶封闭过夜，与兔抗人 Oct-4（1:750）、c-kit、SSEA-4、CD-105（1:1000）、兔抗人 vWF 及多克隆兔抗人β-actin抗体（1:2000）孵育后，再与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（1:4000），室温孵育2h，TBST洗膜3次，荧光试剂盒进行发光，曝光于X光片，顺序显影、定影。

4.Transwell小室检测hAFSC迁移能力：收集第3代的hAFSC计数后分为对照组、实验组。将含有1×107个/L hAFSC的200μl培养液（α-MEM，0.5﹪ BSA）注入Transwell上室，将终浓度40 ng/ml hGF的1200μl趋化缓冲液注入实验组下室，注入1200μl趋化缓冲液至对照组下室，培养24 h，刮除滤膜上室面未移动细胞，95﹪酒精固定，苏木素染色，随机选择3个视野，200倍荧光显微镜下单盲计数下室的细胞数目，每组预设3次实验。

5.明胶贴壁法检测hAFSC黏附能力：收集第3代的hAFSC，0.25﹪胰蛋白酶EDTA消化贴壁细胞，洗涤离心，含0.5﹪ BSA的α-MEM培养液重浮hAFSC，计数后分为对照组、实验组，将1×107个/L细胞悬液200μl接种到明胶包被的24孔培养板，实验组细胞悬液中加入HGF至终浓度为40 ng/ml，37 ℃孵育30min，PBS洗涤3次，移除未贴壁细胞，200倍荧光显微镜下单盲计数贴壁细胞，每个孔随机选择3个不同区域的贴壁细胞，求其平均数。

三、统计学分析方法

应用统计软件SPSS 17.0进行统计分析，两组平均迁移细胞及黏附细胞数以表示，两组间比较采用独立样本t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、hAFSC的免疫荧光鉴定

待细胞长至80﹪融合时，用胰蛋白酶消化收集细胞，免疫荧光显微镜鉴定hAFSC特异性标记物 Oct-4、SSEA-4（图 1）。

二、westernblot鉴定hAFSC标志物

Oct-4、c-kit、SSEA-4、CD105 在 hAFSC 表面均有表达，而HUVEC无表达，相反vWF为内皮细胞的特征标志物在HUVEC上高表达，而hAFSC不表达。表明实验用细胞为典型的hAFSC。（图2）

三、HGF促进hAFSC的迁移

采用Transwell小室分析细胞迁移力。实验组Transwell下室加有HGF，可见大量的hAFSC迁移至下室，平均每个视野的迁移细胞为 (80±3.2)细胞 /每视野（图 3a），对照组平均每个视野迁移细胞数为(38±2.5)细胞/每视野（图3b）。两组相比结果具有显著差异（P < 0.01，图 3c）。

图1 荧光倒置显微镜下观察羊水干细胞的免疫荧光鉴定(×10)

图2 westernblot检测hAFSC

图3 200倍荧光显微镜下观察HGF促进 hAFSC迁移并计数迁移细胞数（苏木素染色×20）

图4 200倍荧光显微镜下观察HGF促进hAFSC黏附并计数黏附贴壁细胞（×20）

四、HGF促进hAFSC黏附

明胶贴壁法测定HGF对hAFSC细胞黏附能力影响。HGF组与对照组每个视野黏附细胞数分别为 (50±2.7)细胞 /每视野和(19±1.5)细胞/每视野。与对照组相比，HGF实验组黏附在明胶上的hAFSC明显增多（图4a），存活数比对照组增多近1倍（图4b），两者之间比较有统计学意义（P < 0.01，图 4c）。

讨 论

羊水干细胞是近年来备受关注的一类具有多向分化潜能的组织干细胞，细胞表型类似于胚胎于细胞和骨髓间充质干细胞，表达转录因子Oct-4，干细胞因子c-kit、周期特异性胚胎抗原SSEA-4等胚胎干细胞特异性标记，说明羊水中含有比间充质干细胞发育更原始、增殖和分化能力更强、更接近于胚胎干细胞的细胞[1-3]。本研究利用贴壁法分离培养羊水干细胞，细胞荧光法及westblot法鉴定证明所分离培养的hAFSC表达Oct-4、c-kit、SSEA-4等特征标志物，与文献报道的羊水干细胞一致。

HGF是一种主要生长因子，又称扩散因子（scatter factor,SF），是骨髓微环境分泌的主要细胞因子之一，HGF与其受体c-Met蛋白结合，可激活受体蛋白质酪氨酸激酶PTK，使受体自身磷酸化，同时使胞浆信使蛋白质磷酸化，启动数条信号通路包括MAPK级联、JNK通路、p38MAPK通路、PI3K-Akt通路、STAT通路和IKBa-NF-KB复合体等，从而调节干细胞的增殖、迁移、黏附等[4-6]。

HGF对在体内外对MSC具有很强的促趋化，黏附作用。Forte等[6]研究发现HGF可促进MSCs的增殖和迁移，其促增殖作用需要p38的参与，促迁移作用则须通过PI3K信号通路。刘红军及郑彦文等研究，均发现HGF能够趋化BMSC的定向迁移，PI3K信号通路参与介导这一过程[7-8]。黄盛东等[9]研究发现在最适浓度下，HGF能显著提高骨髓基质干细胞与纤维连接蛋白涂层的黏附，促进干细胞的迁移和扩散。

目前HGF对于羊水干细胞的迁移黏附的影响未见报道。本实验初步分离培养并鉴定了hAFSC，并采用Transwell小室法和明胶贴壁法初步研究了HGF对于羊水干细胞迁移黏附的影响。实验结果初步表明HGF对羊水干细胞迁移有很强的趋化作用，与对照组对比，迁移能力提高一倍多。HGF还明显提高羊水干细胞的黏附能力，黏附能力提高也近一倍。

HGF对增强羊水干细胞的迁移黏附能力的机制仍有待进一步研究。Forte等[6]研究发现HGF可促进MSC的增殖和迁移，其促增殖作用需要p38的参与，促迁移作用则须通过PI3K信号通路。Roval等[10]研究证实HGF通过与c-Met受体结合，引起受体二聚体发生构象改变，激活PI3K信号通路，进而调节RAC1和P21激酶，引起细胞骨架重组及细胞运动，促进细胞的迁移和黏附能力。因此猜测HGF促进羊水干细胞迁移黏附也是同样机制，此假设有待进一步研究证实。

HGF增强羊水干细胞的迁移和黏附，在羊水干细胞移植治疗肝硬化方面具有重要的意义。肝硬化发生过程中，肝脏损伤部位局部高分泌的HGF可以趋化移植的羊水干细胞“停留”在损伤肝组织局部，有利于羊水干细胞向肝细胞的分化；而且国外研究证实HGF能抗MSC凋亡[6]，同时MSCs通过分泌HGF能抑制肝细胞的凋亡和坏死[11-12]，因此在羊水干细胞移植治疗肝硬化时，HGF可使羊水干细胞的移植存活率升高，进而提高治疗效果。

1 Li C,Zhou J,Shi G,et al.Pluripotency can be rapidly and e fliciently induced in human amniotic fluid-derived cells[J].Hum Mol Genet,2009,18(22):4340-4349.

2 De Coppi P,Bartsch G Jr,Siddiqui MM,et al.Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy[J].Nat Biotechnol,2007,25(1):100-106.

3 Perin L,Sedrakyan S,Da Sacco S,et al.Characterization of human amniotic fluid stem cells and their pluripotential capability[J].Methods Cell Biol,2008,86:85-99.

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5 Neuss S,Beeher E,Woltje M,et al.Functional expression of HGF and HGF receptor/cmet in adult human mesenchymal stem cells suggests a role in cell mobilization,tissue repair,and wound healing[J].Stem cells,2004,22(3):405-414.

6 Forte G,Minieri M,Cossa P,et al.Hepotocyte growth factor effects on mesenchymal stem cells: proliferation,migration and differentiation[J].Stem Cells,2006,24(1):23-33.

7 刘红军,段海峰,鲁茁壮,等.肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响[J].中国实验血液学杂志,2005,13(6):1044-1048.

8 郑彦文,张俊克,周春雷,等.肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞迁移的影响[J].苏州大学学报(医学版),2010,30(4):697-700.

9 黄盛东,刘晓红,白辰光,等.肝细胞生长因子对于骨髓基质干细胞与纤维连接蛋白涂层黏附行为的影响[J].中华实验外科杂志,2006,23(2):218-220.

10 Royal I,Lamarche-Vane N,Lamorte L,et al.Activation of cdc42,rac,PAK,and rho kinase in response to hepatocyte growth factor differentially regulates epithelial cell colony spreading and dissociation[J].Mol Biol Cell,2000,11(5):1709-1725.

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