林盛，饶明月，吴敬波

（泸州医学院临床医学院附属医院肿瘤科，泸州 646000）

鼻咽癌是我国常见恶性肿瘤之一，严重威胁生命健康，同步放化疗是中晚期鼻咽癌的标准治疗模式。拓扑替康（topotecan，TPT）是喜树碱类半合成衍生物，水溶性好，临床治疗证实其可以作为肺［1］、卵巢［2］等恶性肿瘤的二线使用方案，在鼻咽癌［3］的治疗中也有较好疗效。热化疗是一种绿色肿瘤治疗模式，增加患者对化疗药物敏感性，更能有效地杀伤恶性肿瘤细胞的同时减轻化疗产生的毒副作用［4］。超声波因其独特的理化性质，通过改变细胞膜的通透性而增加药物浓度，具备与热疗相似的增效功能，两者之间的差异目前报道较少。因此，本研究以人鼻咽癌细胞株（CNE－2）为对象，观察超声是否对TPT的热化疗杀伤效能有促进作用，并结合电镜对各组细胞的亚细结构损伤性改变进行观察，旨在为超声联合热化疗治疗鼻咽癌提供实验支持。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

TPT粉针（黄石飞云），超声理疗仪（美国CHATTAHOOGA 公司），CCK－8试剂盒（碧云天），透射电子显微镜（日本株式会社），酶标仪（美国BIO－RAD公司）。

1.2 细胞及培养

CNE－2，完全培养基，37℃、5%CO2孵箱常规培养。

1.3 半数抑制浓度（IC50）测定

1.3.1 拓扑替康处理及CCK8测定 贴壁细胞胰酶消化后重悬，调整浓度为5×104／mL，接种96孔板，每孔100μL细胞悬液，置恒温孵箱内培养贴壁，分别加入TPT 20μL，浓度依次为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg／mL，每组3个复孔；作用1 h后，加入CCK8工作液10μL／孔，孵育2h，送检酶标仪（波长450nm）得到OD值，重复3遍后计算IC50。

1.3.2 IC50的计算 抑制率＝（1－实验组 OD值／对照组OD值）×100%，以加药浓度的对数作为X，将生长抑制率作为Y，线形回归后算出抑制率是50%时的加药浓度，即IC50。

1.4 制备细胞悬液

对数生长期细胞经胰酶消化，离心后重悬，调节浓度5×104个／mL，分设单纯超声组、单纯TPT组、单纯热疗组、热疗＋TPT组、超声＋TPT热化疗组及空白对照组（TPT工作浓度0.08μg／mL，取IC50的20%）。

1.5 超声处理

超声处理依据超声理疗仪的性质，探头面积为1cm2，采用连续波，操作时加少许凡士林使冻存管底部与探头接触紧密，作用1min，重复实验3次。

1.6 热疗处理

采用电热恒温水浴箱加热（温度波动＜±0.1℃），先将1只500mL烧杯用铅块固定于恒温水浴箱底部，内盛1.5 cm水共同升温至37℃，将热疗＋TPT组、单纯热疗组、超声＋TPT热化疗组3管捆缚一起置于烧杯底部加热至43℃，恒温处理1h，重复实验3次。

1.7 电镜观察

单纯超声组、单纯TPT组、单纯热疗组、热疗＋TPT组、超声＋TPT热化疗组，各抽取0.5mL细胞悬液于EP管，1 000r／min离心5min，细胞沉淀用戊二醛固定后电镜观察细胞亚细结构。

1.8 统计学处理

采用SPSS 12.0软件进行完全随机方差分析，检验标准为α＝0.05。

2 结果

2.1 细胞培养

CNE－2细胞呈贴壁生长，形态大小各异，核大有分裂，进入对数生长期后隔天传代（见图1）。

2.2 IC50结果

测得OD值计算抑制率，利用直线回归计算出抑制率为50%时的药物浓度即IC50，取3次实验的平均值得出TPT对CNE－2的IC50为0.396μg／mL。

2.3 超声联合

热疗联合TPT对CNE－2的抑制作用：单一处理因素间比较，热疗对细胞株的抑制作用与药物组相当，明显强于超声组，组间比较差异有统计学意义（P＜0.01）。热化疗组、超声＋TPT热化疗组对细胞的抑制作用逐渐增强，组间比较差异有统计学意义（P＝0.000＜0.01）（见表1）。

2.4 电镜结果

2.4.1 对照组与单纯药物组的电镜图像 对照组电镜显示：细胞的核质疏松，胞质中线粒体及内质网结构显示清楚，分裂核象，说明细胞的增殖能力强（见图2）。单纯药物组电镜显示：细胞核中异染色质增多并伴染色质固缩使胞核缩小，重要细胞器有损伤性改变，增殖能力受到抑制（标记为葱皮样改变的髓样结构，提示线粒体或内质网功能出现不可逆损伤性改变，见图3）。

图1 CNE－2细胞（×200）（传代培养后第4天）

表1 超声联合TPT热化疗对CNE－2的抑制效应

2.4.2 单纯超声／热疗组电镜图像 单纯超声组电镜显示：细胞核固缩，线粒体和内质网结构呈现水肿样改变（箭头所示，可逆损伤），提示细胞增殖能力有减弱（见图4）。单纯热疗组电镜显示：细胞核回缩，在核膜周边出现大量高密度异染色质沉积，细胞增殖能力明显抑制（见图5）。

2.4.3 超声联合TPT热化疗电镜图像 热疗联合TPT电镜图像：细胞核中异染色质明显增多，电子密度高，核／质比明显减少伴线粒体减少趋势及髓样结构出现（箭头所示），增殖能力明显减弱（见图6）。超声联合TPT热化疗电镜图像：线粒体水肿明显或者消失，胞质内有大量的空泡结构出现（为细胞器破坏后表现），核质固缩裂解，细胞出现凋亡、坏死趋势（见图7）。

3 讨论

鼻咽癌是我国常见恶性肿瘤，同步放化疗是中晚期鼻咽癌的标准治疗模式。筛选有效的化疗药物作为联合手段能为放疗增益。课题组前期致力研究喜树碱类药物在鼻咽癌治疗中的作用，证实其对鼻咽癌有放射增敏效能［5］。超声的抗瘤效应最早由Szent－Györgyi等［6］在1933年在动物肿瘤模型上证实。随后的研究［7－9］揭示了其可能的抗瘤机制，主要包括空化效应及辐射冲击，使皮肤黏膜或细胞膜的通透性发生改变，从而增加细胞对药物的摄取量，增强对靶细胞的杀伤。大量研究表明，高温能增强某些化疗药物的细胞毒作用，在42℃作用2h能使一些化疗药物抗癌效果增强10～100倍，其作用机制首先是直接的细胞毒作用，热疗的靶器官是细胞膜，加热后细胞膜的主要成分，如磷脂质等受到影响，质膜的流动性和通透性均发生改变；其次，加热改变膜的通透性利于化学药物的渗透和吸收，增加细胞对药物的摄取量使肿瘤细胞内药物浓度提高；高温能抑制药物引起的肿瘤细胞损伤修复，如减少DNA的断裂修复和DNA合成。其他机制［10］包括抑制热休克蛋白（HSP）的累积及使药物反应速度加快，增加温度依赖药物抗肿瘤活性。

综合以上研究背景，本实验探讨超声能否对TPT的热化疗杀伤效应起到促进作用。结果证实，热疗联合TPT后加强了药物的杀伤效应，在相同的药物作用时间前提下，热化疗组对鼻咽癌细胞的抑制效应是强于单纯药物组的；通过电镜对处理后细胞的亚细结构观察，热化疗组的细胞分裂增殖能力明显弱于单纯药物组，细胞器受到更为严重的损伤，说明热疗对TPT有增效作用。超声联合后使TPT热化疗杀伤效应进一步提高，细胞器消亡，细胞处于凋亡坏死状态，说明超声对TPT热化疗杀伤有增效作用。超声是一种波动形式，其振动可引起生物大分子、细胞及组织结构处于激烈的机械运动场中，使其结构功能发生变化；超声波也是一种能量形式，引起细胞膜损伤或增强溶酶体活性及蛋白质损伤而使细胞死亡。由于组织小气泡的存在，超声可引起微小气泡或其周围温度升高，产生的氧自由基及高速微热流使细胞受到严重的损伤乃至破坏［11］。

超声可以作为增效手段为鼻咽癌患者的治疗带来福音，但同时也存在一些问题如超声作用时间长短及强度是否会影响其增益作用，对药物的促渗有无特指性和局限性，有无可能改善化疗药物的耐药及可能的分子机制等都尚待进一步研究加以确认。

［1］Jotte R，Conkling P，Reynolds C，et al.Randomized phase II trial of single－agent amrubicin or topotecan as second－line treatment in patients with small－cell lung cancer sensitive to first－line platinum－based chemotherapy ［J］.J Clin Oncol，2011，29（3）：287－293.

［2］Tsunetoh S，Terai Y，Sasaki H，et al.Effect of a topoisomerase－1inhibitor （topotecan）on the efficacy of cisplatin in in vitro and in vivo platinum－resistant ovarian cancer models［J］.J Clin Oncol，2010，28（15suppl）：e13160.

［3］何丽佳，吴敬波，文庆莲.拓扑替康不同时间给药对人鼻咽癌细胞放射增敏作用的实验研究［J］.临床肿瘤学杂志，2010，15（6）：511－513.

［4］Huang T，Gong W，Li X，et al.Enhancement of osteosarcoma cell sensitivity to cisplatin using paclitaxel in the presence of hyperthermia［J］.Int J Hyperthermia，2013，29（3）：248－255.

［5］吴敬波，文庆莲，范娟，等.拓扑替康对鼻咽癌放射增敏的体内实验［J］.中国耳鼻咽喉头颈外科，2007，14（2）：82－85.

［6］Szent－Györgyi A. Chemical and biological effects of ultrasounic radiation［J］.Nature，1933，130：131－278.

［7］Hagtvet E，Evjen TJ，Olsen DR，et al.Ultrasound enhanced antitumor activity of liposomal doxorubicin in mice ［J］.J Drug Target，2011，19（8）：701－708.

［8］Rapoport N，Nam KH，Gupta R，et al.Ultrasound－mediated tumor imaging and nanotherapy using drug loaded，block copolymer stabilized perfluorocarbon nanoemulsions ［J］.J Control Release，2011，153（1）：4－15.

［9］Knowles J，Sorace A，Heath CH，et al.Ultrasound therapy boosts drug toxicity in vitro and in vivo ［J］.Otolaryngol Head Neck Surg，2011，145（2suppl）：77－78.

［10］Polat BE，Hart D，Langer R，et al.Ultrasound－mediated transdermal drug delivery：mechanisms，scope，and emerging trends［J］.J Control Release，2011，152（3）：330－348.

［11］Zhang XL，Hu AB，Cui SZ，et al.Thermotherapy enhances oxaliplatin－induced cytotoxicity in human colon carcinoma cells［J］.World J Gastroenterol，2012，18（7）：646－653.