雷莉妍,孙晓莉,朱利民,修志明,王丽萍,

(1.吉林大学 生命科学学院,长春 130012；2.吉林大学 中日联谊医院急救医学科,长春 130033；3.博迅生物技术有限责任公司,长春 130012)

过表达HER2/neu可促进乳腺癌细胞的迁移[1-5].利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术可从基因水平上抑制HER2/neu.RNA干扰是一种有效的沉默基因方法,是由21-23 mer双链RNA介导后转录水平的基因沉默[6],如siRNA和shRNA.其中合成的siRNA介导干扰仅产生瞬时效果,shRNA可将干扰片段整合至真核表达载体上,并带入细胞,一定时间内可持续形成shRNA,被Dicer酶剪切为siRNA,从而达到长期的RNA干扰效果[7-14],具有特异性、快速性、遗传性和高效性等特点.

本文构建了针对人乳腺癌HER2/neu的shRNA干扰载体,转染高表达HER2/neu的人乳腺癌细胞SK-BR-3,并观察shRNA对HER2/neumRNA和蛋白的作用效果及对SK-BR-3细胞迁移能力的影响,以筛选有效的干扰靶点,为进一步研究HER2/neu蛋白功能提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂

荧光实时定量聚合酶链式反应(PCR)试剂购自大连宝生物有限公司；人乳腺癌细胞SK-BR-3购自北京协和细胞库；RPMI 1640和OPTI-MEM培养基购自美国Invitrogen公司；胎牛血清购自美国Thermo Scientific公司；pSUPERIOR.puro质粒购自美国Oligoengine公司；pEGFP-N1质粒购自美国BD Biosciences Clontech公司；LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；BglⅡ和HindⅢ购自大连宝生物工程有限公司；蛋白免疫印迹试剂均购自武汉博士德公司;山羊抗人HER2/neu多克隆抗体(sc-31154)和小鼠抗人β-actin单克隆抗体(sc-8432)购自美国Santa Cruz公司.

1.2 方 法

1.2.1 shRNA的设计 本文筛选出HER2/neumRNA (NM_001005862.1)中的3段核苷酸序列作为靶点,根据siRNA的设计原则设计了shRNAs,分别命名为HER2/neu-shRNA-1,HER2/neu-shRNA-2,HER2/neu-shRNA-3和阴性对照HER2/neu-shRNA-C.由文献[15]可知,该阴性对照不具靶向沉默功能.设计的序列由上海生物工程有限公司合成.

1.2.2HER2/neushRNA干扰载体的构建 将pSUPERIOR.puro质粒分别用限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ于37 ℃水浴中酶切2 h,与退火产物(dsDNA)在37 ℃水浴中连接过夜.连接产物转化至感受态DH-5α大肠杆菌上,于固体选择培养基上37 ℃选择培养,挑取阳性克隆提取质粒酶切,产物用质量分数为2%的葡聚糖凝胶分离鉴定,并由深圳华大基因研究院测序.

1.2.3 细胞培养及给药处理 乳腺癌细胞SK-BR-3用RPMI 1640完全培养基(含体积分数为10%的胎牛血清,1.667 μkat/mL青霉素和100 μg/mL链霉素)在37 ℃含体积分数为5%的CO2恒温培养箱内培养.将细胞接种于6孔板中用不含双抗的培养基培养.24 h后,用LipofectamineTM2000作为载体进行转染.转染48 h后用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达.转染24 h后检测HER2/neumRNA水平；转染48 h后检测HER2/neu蛋白水平.

1.2.4 实时定量PCR检测HER2/neumRNA的变化 本文用实时定量PCR检测HER2/neumRNA的变化，以β-actin作为内参[11].实时定量PCR条件：1) 94 ℃变性30 s；2) 58 ℃退火30 s；3) 72 ℃延伸30 s,循环45次,最后72 ℃延伸10 min.HER2/neumRNA相对表达量=2-Δ CT,其中:ΔCT=(CT目的-CT参比)实验-(CT目的-CT参比)对照;CT表示反应过程中管内荧光信号达到阈值时的扩增循环数.

1.2.5 蛋白免疫印迹(Western blot)检测HER2/neu蛋白量的表达 细胞总蛋白样品经SDS-PAGE电泳分离后,转至硝酸纤维素膜上,封闭液封闭2 h后,将膜置于山羊抗人HER2/neu或小鼠抗人β-actin一抗溶液中,4 ℃孵育过夜.洗脱液洗膜3次,用辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗溶液在室温下孵育膜1 h,用化学发光法显色.β-actin作为内参.

1.2.6 细胞划痕实验 当生长在12孔板中的SK-BR-3细胞在70%～80%汇合时,用移液枪头划痕,磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次,去除脱壁的细胞,将划痕拍照.细胞转染48 h后再次拍照.根据划痕宽度变化判断SK-BR-3细胞的迁移情况[12].

1.3 数据统计

采用统计学软件SPSS 10.0进行数据统计分析,结果以平均值±标准差表示,组间比较采用Student’st-test进行显著性检验,P<0.05表示具有显著的统计学差异.

2 结果与分析

2.1 重组质粒构建

构建的重组质粒经测序比对,结果与设计序列完全吻合,表明HER2/neu基因shRNA表达质粒构建成功.干扰序列列于表1.

表1 HER2/neu基因的特异性干扰片段Table 1 Target sequences of HER2/neu gene for RNAi

2.2 转染48 h后报告基因GFP的表达

本文用pSUPERIOR.puro和pEGFP-N1质粒共转染,用荧光显微镜观察细胞中GFP的表达检测转染效率,转染成功的细胞存在GFP表达,结果如图1所示.由图1可见,共转染组细胞中存在显著的GFP表达,转染效率约为45%.

(A) 空载体转染组明场；(B) 空载体转染组暗场；(C) pSUPERIOR.puro和pEGFP-N1质粒共转染组明场；(D) pSUPERIOR.puro和pEGFP-N1质粒共转染组暗场.图1 pSUPER-HER2/neu-shRNA的转染效率Fig.1 Transfection efficiency of pSUPER-HER2/neu-shRNA

2.3 HER2/neu-shRNA重组质粒对HER2/neu mRNA表达的影响

各组质粒转染24 h后,荧光实时定量PCR检测HER2/neumRNA表达情况,引物序列列于表2.结果显示,转染阴性对照质粒组HER2/neumRNA表达量约为空载体转染组的(90.58±5.26)%,t检验显示差异较小.转染HER2/neu-shRNA-1～HER2/neu-shRNA-3质粒组分别为空载体转染组的(15.35±3.02)%,(53.8±15.06)%和(76.86±3.11)%,t检验显示差异较大.其中HER2/neu-shRNA-1对HER2/neu基因表达水平抑制作用最大,如图2所示.

表2 实时PCR引物Table 2 Primers for real-time PCR

2.4 HER2/neu-shRNA对HER2/neu蛋白的影响

HER2/neu蛋白分子量为185 000,用Western blot法检测RNAi对蛋白的影响,结果如图3所示.由图3可见,以空载体转染组作为空白对照,阴性对照组蛋白相对表达量约为(93.94±4.27)%,差异较小.HER2/neu-shRNA-1,HER2/neu-shRNA-2和HER2/neu-shRNA-3质粒转染组HER2/neu蛋白相对表达量分别为空载体转染组的(26.02±3.62)%,(69.31±2.03)%和(78.09±5.29)%,均远低于空白和阴性对照组(P<0.05),其中HER2/neu-shRNA-1质粒转染组目的蛋白的表达水平最低.

1.空载体转染组；2.HER2/neu-shRNA-C阴性对照转染组；3.HER2/neu-shRNA-1转染组；4.HER2/neu-shRNA-2转染组；5.HER2/neu-shRNA-3转染组.图2 转染HER2/neu-shRNA 24 h后HER2/neu mRNA的表达Fig.2 Expression of HER2/neu mRNA after transfection with HER2/neu-shRNA for 24 h

1.空载体转染组；2.HER2/neu-shRNA-C阴性对照转染组；3.HER2/neu-shRNA-1转染组；4.HER2/neu-shRNA-2转染组；5.HER2/neu-shRNA-3转染组.图3 转染HER2/neu-shRNA 48 h后HER2/neu蛋白的表达Fig.3 Expression of HER2/neu protein after transfection with HER2/neu-shRNA for 48 h

2.5 HER2/neu-shRNA重组质粒对SK-BR-3细胞迁移的影响

通过划痕实验研究HER2/neu-shRNA重组质粒对SK-BR-3细胞迁移的影响,结果如图4所示.由图4可见,空载体转染组和阴性重组质粒转染组细胞迁移明显.各重组质粒转染组细胞迁移能力均不同程度地受到抑制,其中HER2/neu-shRNA-1转染组对SK-BR-3细胞迁移抑制最大.这是由于本文构建的干扰质粒可有效抑制HER2/neu蛋白,进而抑制SK-BR-3细胞迁移所致.

1.空载体转染组；2.HER2/neu-shRNA-C阴性对照转染组；3.HER2/neu-shRNA-1转染组；4.HER2/neu-shRNA-2转染组；5.HER2/neu-shRNA-3转染组.图4 转染HER2/neu-shRNA 48 h后SK-BR-3细胞的迁移Fig.4 Migration of SK-BR-3 after transfection with HER2/neu-shRNA for 48 h

综上,本文以HER2/neumRNA序列中的3段核苷酸为靶点,设计了3个shRNA干扰序列,先将其克隆至pSUPERIOR.puro质粒上,再将重组的真核表达质粒转染至人乳腺癌细胞SK-BR-3中,通过荧光实时定量PCR、蛋白免疫印迹和划痕实验检测干扰效果.结果表明,本文设计的shRNAs均可不同程度下调HER2/neumRNA和蛋白水平,从而抑制SK-BR-3迁移,达到基因治疗的目的.其中以质粒HER2/neu-shRNA-1的作用效果最强.

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