刘 新,张纪梅,代 昭

(天津工业大学 环境与化学工程学院,中空纤维膜材料与膜过程国家重点实验室,天津 300387)

由单层碳原子以正六边形紧密排列构成蜂窝状二维平面结构的石墨烯[1],具有较大的比表面积及优异的电学、力学和热学性能[2-3].以金属、金属氧化物和绝缘的聚合物等附着的石墨烯代替无附着的石墨烯可防止薄片在还原过程中重新堆叠,并形成一个新的以石墨烯为基础的纳米复合材料.由于金纳米粒子具有优异的导电性和较好的生物相容性,因此石墨烯-金纳米粒子复合材料在传感器等领域应用广泛[4-6].电化学DNA传感器由一个固定DNA片段(探针DNA)电极和用于检测的电活性杂交指示剂构成[7].通常,将探针DNA分子修饰到电极表面构成DNA修饰电极,由于单链探针DNA与其互补链杂交的高度序列选择性,因此该探针DNA修饰的电极具有极强的分子识别功能.本文采用柠檬酸钠作为绿色还原剂和稳定剂,制备石墨烯-金纳米粒子复合材料,利用该复合物的羧基[8]与末端修饰氨基的DNA键合,制备新型的DNA生物传感器.

1 实 验

1.1 主要试剂与仪器

鳞片石墨购于青岛市莱西县胶体石墨厂.氯金酸、柠檬酸钠、氧化铝抛光粉和蒽醌-2-磺酸钠(AQMS)均为分析纯.所用DNA均由上海英杰生物技术有限公司合成,序列如下：

5′-端用氨基己醇修饰的单链DNA探针：5′-HN2-(CH2)6-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3′;

目标DNA：5′-GGCTGAGAACGGGAAGCTTG-3′;

完全不互补的单链DNA：5′-CGAACGAGAGCAATTCTGGT-3′.

采用紫外-可见分光光度计(Helios-γ型,美国Thermo Spectronic 公司)、X光电子能谱(K-alpha型,英国Thermo Fisher公司)、X射线衍射仪(D8 DISCOVERwith GADDS型,美国BRUKER AXS公司)、场发射扫描电子显微镜(SEM,X-50型,日本日立公司)和透射电子显微镜(TEM,H7650型,日本日立公司)对产物进行表征;采用电化学工作站(LK2006A型,天津市兰力科仪器有限公司)进行电化学测试.

1.2 石墨烯-金纳米粒子复合材料的制备

用改进的Hummers法制备氧化石墨(GO)[9-10],并超声离心配置0.1 mg/mL的氧化石墨烯悬浮液.先将25.0 mL上述溶液加入50 mL容量瓶中,再加入30 mg柠檬酸钠,在100 ℃回流搅拌反应2.5 h,快速加入100 μL氯金酸溶液,继续搅拌回流30 min,得到紫红色的石墨烯-金纳米复合材料溶液.对产品进行反复水洗和离心处理后,置于真空干燥箱中60 ℃ 烘干,研磨成粉末进行结构表征和性能测试.

1.3 基于石墨烯-金纳米粒子复合材料的DNA探针制备

将直径为3 mm的玻碳电极(GC)分别用0.5 μm和0.05 μm的Al2O3浆在麂皮上抛光至镜面,依次用V(水)∶V(乙醇)=1，V(水)∶V(HNO3)=1和二次水超声清洗.将预处理后的GC电极用氮气吹干,先用微量进样器称取制备的石墨烯-金纳米粒子复合材料(RGO-Au)悬浮液(0.5 mg/mL)5 μL滴于GC电极上,再将电极置于电热鼓风干燥箱中37 ℃干燥备用.将上述制备的RGO(RGO-Au)/GC电极浸在1 mg/mL的EDC-NHS(1∶1)溶液中50 min,取出用二次水冲洗去除多余的EDC-NHS溶液.用微量进样器称取10 μL DNA探针(10 μmol/L)滴加在电极表面后在密闭容器内4 ℃恒温自组装1 h,将电极取出,依次用Tris缓冲液和二次水冲洗电极表面以除去未组装的DNA探针,即得到单链DNA修饰的电极(ssDNA/RGO(RGO-Au)/GC).

1.4 双链DNA杂交

将ssDNA/RGO(RGO-Au)/GC电极置于含有目标DNA(10-8μmol/L)的10 mmol/L磷酸盐(PBS)缓冲溶液(pH=7)中,37 ℃恒温组装1 h,依次用Tris缓冲液和二次水冲洗电极表面以除去未杂交的目标DNA,即得到双链DNA修饰的电极(dsDNA/RGO(RGO-Au)/GC).将此电极浸入到1 mmol/L的AQMS杂交指示液中40 min,让其充分嵌入到dsDNA的双螺旋结构中.为了消除背景峰,再将此电极浸入到PBS溶液中1 h,用于电化学检测.

1.5 电化学信号检测

采用循环伏安法和差分脉冲伏安法,以单链DNA或双链DNA修饰的电极为工作电极,铂电极为对电极,饱和甘汞电极为参比电极进行电化学信号检测.检测底液：10 mmol/L PBS缓冲溶液(pH=7).循环伏安法扫描电位为：-0.7～0.1 V,扫描速度为50 mV/s.差分脉冲法参数为：电压范围:-0.6～0 V；电位增量：0.004 V；脉冲幅度：0.05 s；脉冲宽度：0.05 V；脉冲间隔：0.1 s；等待时间：1 s.

2 结果与讨论

2.1 石墨烯-金纳米粒子复合材料的表征

图1 氧化石墨、石墨烯和石墨烯-金纳米粒子复合材料的紫外光谱(A)及其溶液照片(B)Fig.1 UV-Vis spectra of GO,graphene and graphene-AuNPs hybrid (A) and photos (B) of their solutions

图2 氧化石墨(A)和石墨烯-金纳米颗粒复合材料(B)的C1s XPS谱Fig.2 C1s XPS spectra of GO (A) and graphene-AuNPs hybrid (B)

图2为氧化石墨和石墨烯-金纳米粒子复合材料的XPS C1s谱,与氧化石墨相比,石墨烯-金纳米粒子复合材料的XPS C1s谱中含氧官能团的特征峰已显著减弱,表明通过还原反应含氧官能团已大量减少,柠檬酸钠同时还原出了石墨烯和银单体.但仍存在环氧官能团,表明该复合物中含有羧基[8],为探针DNA连接提供了条件.

图3(A)为石墨烯-金纳米粒子复合材料中Au 4f的XPS谱.由图3(A)可见,在83.7 eV和87.4 eV的峰位分别对应Au 4f7/2和Au 4f5/2的结合能,表明所得产物中金的形态为单体.图3(B)为该复合材料的XRD谱.由图3(B)可见,4个明显的衍射特征峰分别对应金的(111),(200),(220)和(311)晶面,表明在所得产物中生成了单体金.由于XRD谱中不存在其他物质的特征峰,表明所得样品纯度较高,峰形尖锐,结晶情况较好.

图3 石墨烯-金纳米粒子复合材料Au 4f的XPS谱(A)和XRD谱(B)Fig.3 XPS spectra of Au 4f doublet (A) and XRD pattern of graphene-AuNPs hybrid (B)

用SEM和TEM表征石墨烯-金纳米粒子复合材料形貌,结果如图4所示.由图4(A)可见,在紧密堆起层状结构的载体石墨烯边缘存在较明显的褶皱与折叠,且在载体表面出现颗粒.为进一步观察金纳米颗粒的负载情况和形貌,将其放大100倍，结果如图4(B)所示.由图4(B)可见,在片层状的石墨烯载体上均匀分散颗粒状的单体金,金纳米颗粒在石墨烯裙皱处分散较密集,且褶皱越大,金颗粒分布的密集程度越高,这是由于褶皱部位更利于附着金纳米颗粒的前驱体——氯金酸所致.图4(C)为石墨烯-金复合材料的TEM照片.由图4(C)可见,颗粒大小相对均一的金纳米粒子较好地分散在褶皱的石墨烯表面.

图4 石墨烯-金纳米粒子复合材料的SEM照片(A),(B)和TEM照片(C)Fig.4 SEM photographs (A),(B) and TEM photograph (C) of graphene-AuNPs

2.2 基于石墨烯-金纳米粒子复合材料制备的DNA传感器的电化学性能测试

图5为不同电极作用下的差分脉冲伏安曲线.由图5可见,dsDNA/RGO-Au/GC电极远大于dsDNA/RGO/GC电极的峰电流值,这是由于金纳米颗粒具有较小的体积、较大的比表面积和较好的生物相容性,使其与DNA分子相互组装而保持DNA生物组分的活性,从而加快了DNA与电极表面间的电子转移.因此,在石墨烯片层中渗入金纳米颗粒,基于石墨烯-金纳米粒子复合材料修饰的DNA电化学生物传感器具有优异的电化学性能.

图6为电极组装过程中不同阶段的电化学测试结果.由图6可见,dsDNA/RGO-Au/GC电极远大于ssDNA/RGO /GC电极的峰电流值,表明AQMS指示剂与杂交反应形成的dsDNA发生嵌入作用提高了dsDNA/RGO-Au/GC修饰电极的电子传导能力.dsDNA/RGO-Au/GC修饰电极电位较ssDNA/RGO-Au/GC修饰电极的电位正向移动了68 mV,与文献[12]结果相符,进一步表明AQMS已嵌入dsDNA中.通过多次重复实验表明,峰电流值明显增大是由于DNA杂交所致.RGO-Au/GC电极大于GC电极的背景电流,进一步说明了石墨烯-金纳米粒子具有优良的导电性能.

图5 不同电极的差分脉冲伏安曲线Fig.5 DPVs of different electrodes

图7 当c(AQMS)=1 mmol/L时DNA探针与完全不互补单碱基错配和完全互补目标DNA杂交后修饰电极的差分脉冲伏安曲线Fig.7 DPVs of after hybridization with non-complementary target DNA and a complementary target DNA at c(AQMS)=1 mmol/L

将ssDNA/RGO-Au/GC修饰电极进行特异性实验,结果如图7所示.由图7可见,在ssDNA探针与完全不互补的寡核苷酸杂交后,其AQMS曲线与杂交前ssDNA探针修饰电极的曲线差异较小,这是由于未发生杂交反应,AQMS无法嵌入到dsDNA的螺旋结构中,因此工作电极上未积累更多的AQMS,峰信号基本不变；当ssDNA探针与单碱基错配的目标DNA序列杂交后,其AQMS峰电流大于杂交前的电流,与完全互补目标DNA序列杂交后,AQMS峰电流比单碱基错配的目标DNA序列峰电流进一步增强.表明基于石墨烯-金纳米粒子固定的ssDNA探针具有较好的序列选择性,可区分完全互补序列和单碱基错配序列,实现对DNA单碱基突变的识别和检测.

本文在相同测试条件下,用相同浓度完全互补的目标DNA进行多次重复测试,所测得的峰电流值分别为8.956×10-5,8.896×10-5,8.903×10-5A,平均值为8.918×10-5A,表明制备的DNA探针具有较好的重复性.

综上所述,本文制备了石墨烯-金纳米粒子复合材料,金纳米粒子均匀分散在石墨烯层上.利用复合物上的羧基与末端修饰氨基的DNA发生键合,制备了DNA探针.通过差分脉冲法检测表明,基于石墨烯-金纳米粒子修饰的DNA传感器可选择性区分单碱基错配的目标DNA序列,该传感器具有较高的特异选择性.

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