魏 杨，徐亚铂，刘向波，康相涛,2，田亚东,2*

(1.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450000；2.河南省家禽种质资源创新工程中心，河南 郑州 450000)

胆固醇，被称为胆甾醇[1]，是动物细胞膜的重要成分之一[2]，许多类固醇激素和胆汁酸生成的前体。对于大多数组织来说，保证胆固醇的供给，维持其代谢平衡是十分重要的。但相关研究表明，胆固醇水平的高低与人类健康有着密切的关系，人体从食物中摄入过量的胆固醇，会使血液中胆固醇含量增加，然而高胆固醇血症是动脉粥样硬化和冠心病的重要致病因素之一[3]。美国相关研究结果表明，通过调节人类膳食中的胆固醇含量，降低血浆中胆固醇含量的1%，可以减少2%的冠心病发病率[3]。

3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)是胆固醇合成过程中的限速酶，在胆固醇合成途径中起到关键调节作用[4]。鸡HMGCR基因位于Z染色体上，包含20个外显子和19个内含子。本研究的目的是探讨HMGCR基因多态性与鸡蛋胆固醇含量之间的关联性，从而为培育出一种低胆固醇含量蛋鸡新品系提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

选取丝羽乌骨鸡健康母鸡225只，单笼饲养于相同的管理条件下。30周龄时连续采集每个个体的鸡蛋3枚，用于测定鸡蛋胆固醇含量。在鸡蛋收集结束后，采集每个个体翅静脉血液。利用酚-氯仿法从血液中提取基因组DNA，并溶解于TE中，保存于4℃直至使用。

1.2 鸡蛋胆固醇含量测定

准确称取5 g蛋黄液用蒸馏水将其定容于50 mL容量瓶中制成原始蛋黄稀释液。吸取原始蛋黄稀释液1.0 mL，分别加入95%乙醇3.0 mL和50%氢氧化钾溶液2.0 mL，置于60℃水浴中皂化60 min。皂化结束后冷却，分别加入5.0 mL正己烷和3.0 mL蒸馏水，混合均匀，静置，直至正己烷与蒸馏水分层清晰。吸取上清液0.5 mL，在40℃下恒温抽真空干燥，随后使用0.5 mL甲醇溶解作为高效液相分析样品。

色谱条件如下：以100%色谱级甲醇做为流动相，进样量为5 μL，在柱温38 ℃、流速为1.0 mL/min的条件下，以205 nm波长进行检测。

1.3 引物设计

根据混合DNA池测序结果发现，在Exon17及Exon18内分别含有一个突变位点，将其命名为g.12217G>T和 g.12684T>C。使用Oligo6.0软件设计特异性引物，所用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物信息见表1。

1.4 PCR扩增及CRS-PCR-RFLP

PCR反应体系为25 μL体系：2×Taq MasterMix 12.5 μL，引物 (10 pmol/μL)各1 μL，DNA模板1 μL，超纯水9.5 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，57.7°C (g.12217G>T) or 62 ℃ (g.12684T>C)退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环，72 ℃延伸10 min。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

CRS-PCR-RFLP反应条件为：10 μL PCR产物、10 U限制性内切酶、2 μL buffer和7.7 μL的 ddH2O混合，37 ℃过夜。酶切产物均使用3.0%琼脂糖凝胶电泳检测分型。

1.5 统计分析

采用Regression对鸡蛋中胆固醇含量做回归方程。根据电泳结果计算基因型频率及等位基因频率。使用PopGene 32软件(population genetic analysis, version 1.31)计算该群体的遗传变异。根据公式计算多态信息含量(Polymorphic Information Content , PIC)[5]及杂合度(heterozygosity, H)[6]。利用SPSS 17.0中的一般线性模型分析不同基因型与相关性状的关联性。模型如下：

Y =μ+ G+E

式中：Y为个体表型值，μ为群体均值，G为标记基因型效应，E为随机误差；成对比较采用SPSS17.0分析软件Borferroin法。

2 结果与分析

2.1 丝羽乌骨鸡蛋胆固醇含量测定

对225只30周龄丝毛乌骨鸡所产的675枚蛋进行鸡蛋胆固醇含量测定，结果见表2。标准胆固醇溶液(a)及蛋黄样品(b)的高效液相色谱分离结果见图1。在选择的色谱条件下，胆固醇的保留时间为9 min。以胆固醇浓度分别为0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mg/mL的标准胆固醇工作液上样，上样量为5 μL，以峰面积为纵坐标Y、胆固醇浓度为横坐标X绘制标准曲线(如图2所示)，并进行线性回归，回归方程为Y=2258X+12.33，相关系数R2=0.999。根据此公式计算出蛋黄中胆固醇含量及全蛋中胆固醇含量(表2)。

表2 丝羽乌骨鸡鸡蛋胆固醇含量测定Table 2 The determination silkies' egg cholesterol

图1 高效液相色谱图 Fig.1 HPLC Finger Print a.标准胆固醇样品；b.蛋黄样品a.Standard cholesterol samples；b.Egg yolk sample

图2 胆固醇浓度标准曲线Fig. 2 The standard curve of cholesterol

2.2 鸡HMGCR基因遗传变异的检测

为了在鸡HMGCR基因的PCR产物中创造HinfI限制性内切酶的识别位点，在g.12217G>T引物对的下游引入一个错配位点。PCR产物经消化后使用3.0%琼脂糖凝胶进行分型，酶切图片显示了三种基因型，分别被命名为GG (141+21)bp, GT (162+141+21)bp, TT (162bp)；采用导入Eco88I限制性内切酶切位点的方法，对g.12684T>C突变位点设计引物对其进行PCR-RFLP。对扩增片段进行酶切消化后后，使用3.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，酶切结果显示三种带型，分别命名CC (250+22)bp, CT (272+250+22)bp, TT (272bp)，如图3所示。

2.3 群体遗传学分析

该群体遗传学分析见表3。由表3可知：群体中g.12217G>T突变位点的TT基因型频率(0.084)和T等位基因频率(0.477)较低；g.12684T>C突变位点TC基因型个体出现的频率(0.829)远远高于其他两种基因型。G.12217G>T和g.12684T>C两个突变位点的杂合度为中等水平，可知这两个等位基因群体内遗传变异的程度不大；多态信息含量值均为中度多态(0.5>PIC>0.25)。

图3 HMGCR基因酶切产物电泳图(3.0%琼脂糖) Fig. 3 3.0% agarose gel electrophoresis for digesting HMGCR gene PCR Product

表3 群体中两个SNPs位点群体遗传学分析Table 3 Population genetic analysis of the two SNPs in the population

2.4 HMGCR基因各突变位点与丝毛乌骨鸡蛋胆固醇含量的关联分析

g.12217G>T及g.12684T>C突变位点不同基因型与丝毛乌骨鸡蛋胆固醇含量之间的关联性分析见表4。G.12217G>T突变位点仅对鸡蛋中胆固醇含量具有显著的影响(P<0.1)，GG基因型鸡蛋中胆固醇含量显著低于其他两种基因型。G.12684T>C突变位点仅对蛋黄重具有显著影响(P<0.1)，CC基因型的蛋黄重最大。

3 讨 论

随着我国经济的快速发展，人们消费水平极大提高及膳食中动物性食品比重的逐渐增加, 人们在追求畜产品数量的同时，对其风味、感观满意程度及保健功能也提出了更高的要求[7]。鸡蛋是人们日常必备的动物性食品之一，但鸡蛋中较高的胆固醇含量都已成为制约市场需求量的重要因素。

3.1 胆固醇在产蛋鸡体内的代谢

体内胆固醇的来源分为外源性吸收和内源性合成两部分。外源性吸收主要源于饲料，内源性合成主要源于肝脏。产蛋鸡的脂质代谢与哺乳动物不同，产蛋鸡摄入的饲料以植物饲料为主，所以产蛋鸡从饲料中摄入的胆固醇含量很少，其主要是通过自身的胆固醇合成来满足自身生理及生产的需要。蛋鸡每天合成约300 mg胆固醇，其中大约2/3沉积在鸡蛋中[8]，10 mg左右直接排入肠道[9]，其余的则发生转化(如类固醇激素、维生素D3等)和形成膜结构。对于产蛋鸡而言，肝脏和卵巢是合成胆固醇的主要场所。肝脏不仅是脂质合成速度最快，也是合成量最多的器官，是机体最活跃的合成部位和血浆中胆固醇的主要来源[8]。胆固醇合成过程比较复杂，有近30步反应，整个过程可分为3个阶段[10]。乙酰CoA是胆固醇合成的直接原料，它来自葡萄糖、脂肪酸及某些氨基酸的代谢产物。另外，还需要腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)供能和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)供氢进行一系列的氧化还原反应，经过生成HMG-CoA、甲羟戊酸、鲨烯、羊毛固醇等中间产物，最终生成胆固醇。合成1分子胆固醇需消耗18分子乙酰辅酶A、36分子ATP和16分子NADPH。其中HMGR-CoA还原酶在生成甲羟戊酸这一过程中决定了合成反应的快慢，也是外界调控体内胆固醇合成的主要靶点。

表4 HMGCR基因g.12217G>T和g.12684T>C不同基因型与鸡蛋性状的关联分析Table 4 Associations of g.12217G>T and g.12684T>C genotypes of the HMGCR gene with egg traits

3.2 HMGCR基因两个多态位点与鸡蛋胆固醇含量相关性分析

随着人的老龄化，心血管疾病逐渐成为威胁人类健康的杀手，临床和流行病学研究发现动脉粥样硬化是导致心血管疾病的重要因素，而高脂、高胆固醇膳食与动脉粥样硬化有着密切关系。膳食胆固醇(CHOL)主要来源于动物性食物，鸡蛋是动物性食品中CHOL含量较高的一种，平均213 mg/枚[11]。1972年，美国膳食研究委员会采纳了美国心脏研究协会的观点，建议每天摄入胆固醇应少于300 mg，为遵循这一建议，每周食用全蛋不宜超过3枚[12]。人们由于担心胆固醇过高会引起动脉粥样硬化，从而减少了鸡蛋的食用，这就是美国和加拿大鸡蛋消费下降的重要原因[11]。

陆俊贤等[13]对我国7个品种蛋鸡的鸡蛋胆固醇含量进行了测定，结果发现我国地方鸡种鸡蛋的胆固醇含量平均约为196 mg/枚，低于国外鸡种，但是差异不明显。杨朋坤[14]对四个品种鸡蛋的胆固醇含量进行了研究，结果发现丝羽乌鸡蛋的胆固醇含量最高，31周龄丝羽乌骨鸡鸡蛋胆固醇含量约为262.9339 mg/100 g鸡蛋。本试验中丝毛乌骨鸡鸡蛋的胆固醇含量平均约为456.6 mg/100 g 鸡蛋，明显高于他们的研究结果，由于不同的饲养环境及饲粮组成的差异所造成的偏差。

孙宪如[15]建议在降低胆固醇方面应该利用杂交优势，选择胆固醇含量最低的蛋作为种蛋，可使后代所产蛋中胆固醇含量降低5%～7%。CaPo(1995)报道通过杂交得到的品种每克蛋黄胆固醇含量和其他与之相比较的品种间差异显著。蛋黄胆固醇浓度的值变异较大，大约为20%～40%，蛋黄中胆固醇的含量与遗传具有一定的关系，其遗传力约为0.21～0.26[16]，且性状的表达受环境因素影响较大，通过常规遗传育种手段很难有效稳定地降低蛋黄胆固醇，因此我们需要通过选育或基因突变来获得产低胆固醇鸡蛋的新品系[17-19]。

蛋黄胆固醇浓度或鸡蛋胆固醇含量为数量性状其表达受一系列微效基因的调控，其中包括3-甲基-3-羟基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)基因[20]、载脂蛋白B(APo-B)基因、卵母细胞卵黄生成受体(OVR)基因等[21]。HMGCR是机体合成胆固醇过程中的限速酶，APo-B在血液中与胆固醇结合，起到运输的作用，而OVR则通过内吞作用介导脂蛋白完整转运进入生长中的卵母细胞，最后使胆固醇沉积在蛋黄中。从这些基因中寻找出影响胆固醇含量的分子标记，然后对低胆固醇品系进行标记辅助选择，对加快选育进程具有重要的作用。

4 结 论

本试验中HMGCR基因g.12217G>T位点与鸡蛋中胆固醇含量显著相关，其中GG基因型个体显著小于GT基因型和TT基因型个体；HMGCR基因g.12684T>C位点对蛋黄重具有显著的影响，其中CC基因型个体显著大于TT基因型和TC基因型个体，将这两个位点的结果结合在一起，我们可以得到野生型个体鸡蛋的蛋黄重且鸡蛋中胆固醇含量低，这一结论有利于日后对产低胆固醇鸡蛋新品种的选育，可以避免鸡蛋中胆固醇含量高但蛋黄小这一缺点，可以更好地满足消费者的消费心理。

参考文献:

[1] 王镜岩,朱圣庚,徐长法.生物化学(上册)[J].3版.北京：高等教育出版社，2002.

[2] 毛应华.胆固醇对细胞膜结构和功能的影响[J]. 国外医学卫生学分册，2004,31(6):352-355.

[3] LRCP.The lipid research clinic coronary Primary trial results.The relation of reduction in incidence of coronary heart disease to cholesterol lowing[J].J Am Med Assn,1984,251:365-374.

[4] Goldstein J L,Brown M S.Regulation of the mevalonate pathway[J].Nature,1900,343(6257):425.

[5] Botstein D,White R L,Skolnick M,et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. Am J Hum Genet,1980,32:314-331.

[6] Nei M,Li W H. Mathematic model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleaes[J]. PNAS (USA).1979,76:5 269-5 273.

[7] 张佳程,骆承庠.生物方法降低食品中胆固醇的研究趋势[J].食品科学,1997,18(11):50-53.

[8] Naber E C. Nutrient and drug effects on cholesterol metabolism in the laying hen[J]. Federation Proc, 1983, 42:2 486-2 493.

[9] Sim J S, Kit t s W D, Bragg D B. Influence of dietary oil, cholesterol, and soysterol on fecal neutural and acidic steroid excretion in laying hens[J]. Poultry Sci, 1980, 59:325-327.

[10] 王晓凤．猪HMGR基因的克隆、表达、染色体定位及多态性分析[D]．北京：中国农业大学，2006．

[11] 王彦文.对低胆固醇鸡蛋的新认识[J].中国畜牧兽医,1995,22(2):35.

[12] Herron K L, Fernandez K L.Are the current dietary guidelines regarding egg consum ption appropriate[J].The Journal of Nutrition,2004,134(1):187-190.

[13] 陆俊贤,葛庆联,施祖瀚，等.不同品种鸡蛋中胆固醇含量比较[J].中国家禽,2010,32(8):64-65.

[14] 杨朋坤.不同品种鸡蛋胆固醇沉积规律和相关基因表达的研究[D].郑州：河南农业大学,2011.

[15] 孙宪如.蛋黄胆固醇含量与某些性状的相关研究[J].西南民族学院学报：自然科学版,1994(1):123-125.

[16] 崔学平,斯大勇,崔扬健.鸡蛋胆固醇问题的思考,内江职业技术学院学报,2008,2(4):63-66.

[17] Bair,Marion.Yolk cholesterol in eggs from various avian species[J].Poult Sci,1978,57:1 260-1 265.

[18] Klicka J.Feeding drinking and excretion[M]∥New York：USA.Turtles PersPectives and Research，1979：229-246.

[19] Rail T W.Central nervous system stimulants[C]∥Gilman A G,Goodman L S,Gilman A. In the Xan-thines in the Pharmacological Basis o f TheraPeutics.New York：Macmillan,1981：592-607.

[20] Ding J X,Jiang D C,Kurczy M,et al.Inhibition of HMG CoA reductase reveals an unex pected role for cholesterol during PGC migration in the mouse[J].BMC DeveloPmental Biology,2008,8:120-134.

[21] 陈东军.鸡蛋含量相关性研究胆固醇代谢候选基因SNPs筛查及其与蛋黄胆固醇[D].合肥:安徽农业大学,2010.