孙 钰，齐玉凯，刘丽英，李显耀,3*

(1.山东农业大学 动物科技学院，山东 泰安 271018;2. 山东农业大学 生命科学学院，山东 泰安 271018;3.山东省动物生物技术与疫病防治重点实验室, 山东 泰安 271018)

Toll样受体(TLR)是天然免疫系统中一类PRRs(模式识别受体)，是一类广泛存在于昆虫、植物和脊椎动物中进化上高度保守的蛋白质家族[1]。TLR4是Toll样受体家族的重要成员。鸡TLR4基因属于I型跨膜蛋白受体，位于17号染色体，全长4 452 bp，包含三个外显子，编码843个氨基酸[2-3]。TLR4主要识别革兰氏阴性菌细胞膜上的重要成分LPS[4]。Arbour等[5]发现人TLR4基因的Asp299Gly和Thr399Ile多态性与吸入LPS后的低应答相关。Lorenz等[6]发现Asp299Gly和Thr399Ile多态性在G-细菌引起的中毒性休克中起一定作用。Leveque等[3]、李鹏等[7]，宋咏梅[8]分析了鸡TLR4第三外显子SNPs及其基因表达水平与沙门氏菌感染的相关性。基因的功能最终要通过蛋白来行使，TLR4基因的变异也是通过改变TLR4蛋白结构而发挥作用。山东省拥有丰富的地方鸡品种资源，如寿光鸡、济宁百日鸡和汶上芦花鸡、琅琊鸡等优良品种。这些品种具有肉质风味好，产蛋量高，性成熟早、抗病力和适应性强等突出优点[9]。作为生物多样性的组成部分，地方品种资源基因库是未来鸡品种改良和适应生产条件变化的遗传基础[10]。本研究拟分析TLR4外显子SNPs对TLR4蛋白结构的影响，并检测对蛋白结构具有重要影响的SNPs在地方鸡种和商业鸡种中的遗传变异，进一步完善TLR4基因的SNPs信息，为TLR4基因的功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

济宁百日鸡、莱芜黑鸡、汶上芦花鸡、鲁西斗鸡、寿光鸡均来自原种场，海兰褐和AA肉鸡商品代来自山东农业大学动物科技学院试验鸡场，每个群体随机抽取60只鸡，翅下静脉采血1 mL，EDTA抗凝并置于-20 ℃保存备用。

1.2 基因组DNA提取

使用血液DNA提取试剂盒提取鸡基因组DNA(天根生化科技有限公司，北京)，提取后使用Eppendorf紫外分光光度计检测DNA浓度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

1.3 TLR4基因多态位点的鉴定

根据NCBI数据库中鸡TLR4基因序列(GenBank登录号：NC_006104)，采用Primer 5.0软件设计7对引物(表1)，由上海生工生物工程有限公司合成。从7个鸡群的420个DNA样品中各取1 μL构成DNA池。以此为模板，用7对引物进行PCR扩增获得TLR4三个外显子序列。反应体系(25 μL)为2.5 μL 10×PCR buffer(含Mg2+)，2.0 μL dNTP (10mM)，上下游引物(10 pM)各0.5 μL，70 μg DNA模板，0.2 μL rTaq酶(5U/μL)和适量无菌水。PCR反应条件为94 ℃ 5 min，35个循环(94 ℃ 30 s，最佳退火温度(表1)，72℃ 30 s)，最后72 ℃延伸5 min。琼脂糖电泳检测扩增产物，然后将PCR产物送往上海生工生物工程有限公司测序。

表1 TLR4基因测序引物及扩增信息Table 1 The primer sequences and amplification condition of TLR4 gene

1.4 TLR4基因多态位点选择及基因分型

根据测序结果判断多态性位点，并通过单个个体直接测序进行验证，对确认的非同义突变通过TMHMM2.0、SOPMA及Protscal软件在线分析其对TLR4编码蛋白结构和功能的影响，选择对TLR4编码蛋白具有影响的位点进行基因型分析，PCR反应体系和反应条件如1.3所述。

1.5 SNP位点的遗传多样性分析

利用R软件中的genetics程序包计算基因型频率、等位基因频率、杂合度(He)和多态信息含量(PIC)。

2 结果与分析

2.1 TLR4基因多态位点的鉴定结果

7对引物PCR产物的测序结果表明，TLR4基因共检测到17个SNPs位点。其中第一外显子1个，第二外显子2个，第三外显子14个。

2.2 C77T和G247A位点对TLR4蛋白结构的影响

通过分析各SNP位点对TLR4蛋白结构的影响，结果发现C77T和G247A位点对TLR4编码蛋白的亲水性及跨膜区有影响(表2)。

由表2可知，C77T位点由C→T发生改变时，TLR4编码蛋白质的跨膜螺旋中氨基酸的期望数目、蛋白质前60个氨基酸的跨膜螺旋氨基酸的期望数目、N端在细胞膜内侧的总概率及该位置的Proscale得分分别增加了1.49、1.38、0.049和0.267，增加比例分别为3.86%、7.60%、6.30%和13.81%；G247A位点碱基改变时TMHMM预测结果及Proscale得分未有明显改变。G247A位点由G→A发生改变时，TLR4编码的蛋白质中α-螺旋和延伸链的比例分别由48.64%升高到54.92%，2.14%升高到2.61%；β-转角及随机卷曲的比例由13.29%下降到10.81%，35.94%降到31.55%，C77T位点碱基改变时对α-螺旋、β-转角、延伸链和随机卷曲的影响不大。

2.3 TLR4外显子两多态位点的直接测序结果

如图2所示，C77T位点存在GG、GA、AA三种基因型，G247A位点存在CC、TC、TT三种基因型。

2.4 TLR4基因两位点的遗传多态性分析

利用直接测序法对C77T和G247A位点在7个不同品种中的基因型进行鉴定，计算基因型频率、等位基因频率、杂合度、多态信息含量，并进行Hardy-Weinberg平衡检验。

表2 C77T和G247A位点对TLR4蛋白结构的影响Table 2 The effect of C77T and G247A loci on the structure of TLR4 protein

注：E1. 跨膜螺旋中氨基酸的期望数目；E2.蛋白质前60个氨基酸的跨膜螺旋氨基酸的期望数目；P. N端在细胞膜内侧的总概率。

Note：E1.The expected number of amino acids in transmembrane helices；E2.The expected number of amino acids in transmembrane helices in the first 60 amino acids of the protein; P. The total probability that the N-term is on the cytoplasmic side of the membrane.

图1 TLR4外显子2多态性位点的测序结果a，b分别为C77T，G247A位点的PCR产物测序结果；测序引物为反向引物Fig.1 The sequencing results of two loci of TLR4 genesa and b are the sequencing results of C77T and G247 loci, respectively；The reverse primer was used for sequencing

C77T多态位点在7个鸡群中的基因型频率和等位基因频率及x2适合性检验结果见表3。

由表3可知，CC基因型频率为0.58～1.00，TT基因型频率为0～0.03，CT基因型频率为0～0.38，等位基因C的频率为0.78～0.99；海兰褐中所有个体均为等位基因C，而没有检测到等位基因T。该位点杂合度为0.017～0.352，其中鲁西斗鸡最低，为0.017，寿光鸡最高，为0.352。C77T的多态信息含量为0.012～0.288，其中寿光鸡最高，为0.288。x2适合性检验表明C77T位点在海兰褐和汶上芦花鸡两个群体中偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)，在其余5个群体中都处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。

由表4可知，GG基因型频率为0.07～0.85，AA基因型频率为0～0.28，AG基因型频率为0.13～0.90，等位基因G的频率为0.45～0.92。杂合度为0.154～0.503，其中寿光鸡最低，为0.154，海兰褐和济宁百日鸡最高，为0.503。该位点PIC在寿光鸡中最低，为0.141，在济宁百日鸡最高，为0.374。x2适合性检验结果表明G247A位点在海兰褐和AA肉鸡两个商业品种中偏离了Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05)，在其余5个地方鸡种中都处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。

表3 TLR4基因C77T位点基因频率和等位基因频率的分布Table 3 The frequency distributions of genotype and alleles of C77T locus

表4 TLR4基因G247A位点基因频率和等位基因频率的分布Table 4 The frequency distributions of genotypes and alleles of G247A locus

3 讨 论

TLR4及其信号通路在人类疾病中发挥着重要作用。TLR4在沙门氏菌感染抗性的研究中具有较大优势，Leveque等[3]对沙门氏菌易感和抗性品系鸡TLR4基因序列进行研究，发现胞外区第三外显子中383和611两个位点的突变只出现在沙门氏菌易感品系鸡中。当鸡感染沙门氏菌后，盲肠、脾组织中的TLR4基因的表达量会增加[11-12]。TLR4的903和1832两位点的碱基改变，会引起TLR4与沙门氏菌结合效率的改变，从而引起机体的抗感染反应[8]。但TLR4基因的突变造成异常表达与抗沙门氏菌感染的关系和机制还不清楚。

本研究中，TLR4三个外显子在7个鸡群中共存在17个SNPs，包含10个同义突变，7个非同义突变；其中7个非同义突变在第一、二外显子上各1个，第三外显子上5个。有人在北京油鸡等12个鸡群中也检测到了位于第一、二外显子上的C77T和G247A非同义突变位点[8]，与本研究结果一致。C77T多态位点，在海兰褐中仅检测到CC型，在其他6个鸡群中该位点的基因型频率和等位基因频率相差不大。在长期的人工选择和自然选择中，该位点可能未受到明显影响。G247A位点在5个地方鸡种中均处于Hardy-Weinberg平衡状态，而在2个商业鸡种中偏离了Hardy-Weinberg平衡状态，可能是AA肉鸡和海兰褐在选育过程中所经历的高强度人工选择影响了该位点的分布。

本研究结果表明，寿光鸡C77T位点的PIC为0.352，属于中度多态，其它6种鸡群的PIC均为低度多态，而G247A位点除寿光鸡的PIC较低外，其余6个鸡群PIC为0.369～0.374，属于中度多态。对于只有两个等位基因的标记或基因来说，其最大的多态信息含量(PIC)只有0.375[13]，该位点的多态信息含量较高，可以作为分子标记，为下一步进行TLR4基因不同基因型与鸡革兰氏阴性菌感染抗性的关联分析提供重要的参考依据。寿光鸡是我国形成历史较早的地方优良品种之一，适应性和抗逆性较强，遗传性能稳定[10]。寿光鸡TLR4基因2位点PIC与其它6个鸡群的差异是否与其某种生产性能或沙门氏菌抗性有关，还需进一步的试验研究。

鸡TLR4蛋白由胞外区、跨膜区和胞内区3个功能区域组成。胞外区含有大约16～28个亮氨酸重复序列(LRR)[14]。LRR特征是亮氨酸间隔分布于几个固定位点，可加强蛋白质之间的黏连，有利于LRR参与对病原微生物或其产物的特征性识别，进而激活TLR4通路[15]。SMART软件预测显示C77T处于跨膜区，G247A位于第一个LRR中，本文通过TMHMM2.0、SOPMA及Protscal软件分析预测C77T和G247A多态位点的改变对TLR4所编码的蛋白质二级结构和跨膜功能有一定的影响，但这种改变是否影响整个TLR4信号通路的激活，是否与抗沙门氏菌感染相关还需进一步研究。

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