吴 健 刘红芝 张 芳 付燕燕 王淑玲 宋远见

(1.徐州医学院，江苏 徐州 221004；2.徐州医学院 附属市立医院，江苏 徐州221000)

0 引言

Akt信号通路调控细胞增殖和生长，参与细胞凋亡及糖代谢过程，是细胞信号转导网络的重要枢钮之一。Akt1信号通路是肿瘤细胞中最活跃的通路之一，Akt1基因在多种肿瘤组织中存在过表达[1]。探讨Akt1基因的功能对于研究细胞凋亡及肿瘤发生和发展具有重要意义，Akt1基因的体外合成和构建真核细胞基因表达质粒可以为Akt1基因功能及相关疾病的研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

Pfu DNA polymerase购自生工生物工程（上海）有限公司，琼脂糖和DNA凝胶回收试剂盒（离心柱型）均购自天根生化科技（北京）有限公司，DNA内切酶、DNA连接酶和DNA marker均购自MBI Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 用PCR方法对大鼠Akt1序列进行基因合成

1）oligo设计合成，目的基因上下游分别加上NheI和BamHI及保护碱基，用于基因合成后的亚克隆。

2）oligo合成。

3）将oligo溶解成50μM，将oligo分别取相同体积至1.5ml离心管，混合均匀，配成oligo mix。

4）用配制好的oligo mix进行第一轮PCR反应，循环条件：95℃3min 1 cycle；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 30sec 30 cycles；72℃ 5min 1 cycle。

5）第二轮PCR反应，模板为第一轮PCR反应的产物。反应条件与第一轮相同。第一轮PCR可得到混有目的基因条带的非单一条带PCR产物混合物，再用第一轮的PCR产物为模板，通过第二轮PCR则可获得单一的目的基因条带。

6）电泳，回收大鼠Akt1基因片段。

1.2.2 大鼠Akt1克隆到pGCMV/MCS/RFP/Neo中并用酶切法验证

1）用NheI和BamHI对大鼠Akt1基因的片段进行酶切，37℃酶切2小时；

2）用 NheI和 BamHI对 pGCMV/MCS/RFP/Neo进行酶切，37℃酶切2小时；

3）电泳，用DNA凝胶回收试剂盒回收双酶切的大鼠Akt1基因片段和载体pGCMV/MCS/RFP/Neo；

4）用T4 DNA ligase连接双酶切得到的大鼠Akt1基因片段和线性化的载体，22℃连接2小时；

5）取10μl连接产物转化100μl感受态细胞Top10，均匀涂布于50μg/ml Ampicillin平板，倒置于37℃培养箱中培养约16小时；

6）挑取阳性克隆抽提质粒，用酶切法验证。

2 结果

大鼠Akt1 PCR电泳图片如图1所示。

大鼠Akt1-pGCMV/MCS/RFP/Neo重组质粒NheI和BamHI双酶切鉴定图片如图2。

图1 大鼠Akt1 PCR电泳1.大鼠 Akt1 PCR；2.marker MBI SM0331；3.marker MBI SM0331.

图2 大鼠Akt1-pGCMV/MCS/RFP/Neo重组质粒NheI和BamHI双酶切鉴定4.重组质粒 NheI和 BamHI双酶切；5.marker MBI SM0331.

3 讨论

蛋白激酶B(Akt)是丝／苏氨酸激酶家族成员，是细胞信号传导的重要枢钮之一。Akt的功能复杂多样，其底物迄今已发现有50余种蛋白[2]。 哺乳动物基因组中有三种 Akt，即 Akt1、Akt2，Akt3，在脑中 Akt1的含量最高，其活性的下降与脑缺血损伤后神经细胞的凋亡相关[3]。Akt参与细胞增殖和凋亡等多方面的调节，是细胞生长的调控中枢。Akt是原癌基因，细胞内的P13K可促进Akt的激活，后者再激活mTOR，从而调控细胞周期，在肿瘤发生、发展的信号传导过程中发挥重要作用。在肝癌、胃癌、血癌、胰腺癌等多种肿瘤中均发现PI3K-Akt信号通路的活化[4]。

体外合成Akt1基因并构建真核细胞基因表达载体可用于该基因相关功能和机制的研究，从而为脑缺血损伤、肿瘤发生发展等方面提供重要基础。

［1］黄秀兰，崔国辉，周克元，等.PI3K-Akt信号通路与肿瘤细胞凋亡关系的研究进展[J].癌症，2008，27（03）：331-336.

［2］AyraI-Kaloustian S,Gu J,Lucas J,et a1.Hybrid inhibitors of phosphotedylinositol 3-kinase(PI3K)and the mammalian target of rapamycin(mTOR):design,synthesis,and superiorantitumoractivity ofnovelwortmannin-rapamycin conjugates[J].Med Chem，2010，53（01）： 452-459.

［3］刘革修.脑缺血损伤与 Akt研究的进展[J].中国临床康复，2005，9（21）：167-169.

［4］Missiaglia E,Dalai I,Barbi S,et al.Pancreatic endocrine tumors:expression profiling evidences a role for Akt-mTOR pathway[J].J Clin Oncol，2010，28（02）：245-255.