李晓冲，张秀英，徐 尚，李 宏，张燕华

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨150030）

人类饮食结构的改变，导致非酒精性脂肪肝的发病率逐年上升。非酒精性脂肪性肝病（non－alcoholic fatty liver disease，NAFLD）包括：单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎和肝硬化3个病理阶段。脂肪性肝炎为预后较差的一个阶段，可进一步发展为肝硬化甚至肝细胞癌［1］，目前尚无明显有效的治疗方法。动物模型在探索疾病的发病机制、评价诊断方法、筛选防治药物等领域均有重要作用。近年来，许多学者利用试验动物复制非酒精性脂肪肝病理模型并对其进行了大量的研究，取得了许多成果。其中C57BL/6J小鼠对高脂较敏感，是理想的建模动物。本试验采用高脂饲料和高脂与四氯化碳联合诱导，并比较了两种诱导方法以及诱导时间对非酒精性脂肪肝的变化与进程的影响，目的是探索建立较理想动物模型的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 近交系 C57BL/6J小鼠，SPF级，9～10周龄，共60只，雄性。由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供，生产许可证号：scxk黑2006－009。

1.1.2 药物与试剂 所用药品为分析纯由天津虔诚伟业科技发展有限公司提供，生化试剂盒由南京神州英诺华医疗科技有限公司提供，油红O试剂由Sigma公司提供。

1.1.3 仪器 RM2135切片机，冷冻切片机（德国莱卡公司），英诺华自动生化仪。

1.2 方法

1.2.1 高脂饲料制备 高脂饲料：15%猪油，1%胆固醇，0.5%胆盐，15%糊精，68.5%基础饲料。猪油是由市场购买的经检验合格的动物脂肪熬制所得。

1.2.2 分组与模型建立 小鼠按随机原则分为正常组、高脂组和高脂复合四氯化碳组（复合组），每组20只。所有动物适应饲喂1周后，正常组饲喂普通饲料，高脂组饲喂高脂饲料，复合组除饲喂高脂饲料外，首次每只小鼠以0.72mL/100g剂量皮下注射CCl4溶液，以后每周1次以0.42mL/100g剂量皮下注射40%的CCl4－植物油（V/V）溶液，连续3周。各组分别于第4、6、8周，取5只小鼠进行称重剖杀，取血分离血清，剖检，取肝脏称湿重；取肝组织固定，分别进行H.E.染色和油红O染色，做病理学检查。

1.2.3 观察指标和测定方法 一般检查：试验期间每周称小鼠体量1次，并观察其毛色、食欲、行动、对外界刺激的反应情况；病理组织学检查：肉眼观察小鼠肝脏大体变化，采用H.E.染色和油红O染色，光镜下观察小鼠肝脏病变；血液生化指标的检测：谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）、谷酰转肽酶（GGT）、甘油三酯（TG）和总胆固醇（T－CHO）等血液生化指标采用全自动生化仪分析。

1.2.4 评价标准及统计学处理 判断标准参见中华肝病学会脂肪肝和酒精性肝病学组制定的《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》（2010年修订版）［2］。计量资料用X±S表示，两组间均数的比较采用t检验，用SAS9.1软件统计分析，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 小鼠一般指标 试验过程中，与对照组小鼠相比，高脂组和复合组小鼠毛发油腻、凌乱。食量减少，对外界刺激的反应较迟钝。与对照组小鼠相比，高脂组和复合组小鼠体重均呈下降趋势，且差异极显著（P＜0.01）；肝指数上升，第4周差异显著，6～8周差异极显著（P＜0.01）。复合组与高脂组相比，第8周肝指数差异达显著水平（P＜0.05）。见表1。

表1 小鼠体重、肝重和肝指数比较

2.2 病理学变化 肉眼观察，8周时，正常组小鼠肝脏外观呈红褐色，表面光滑，边缘锐利，质软有弹性；高脂组与复合组小鼠肝脏肿大易碎、包膜稍紧张、边缘圆钝、呈棕黄色、切面有油腻感，且胆囊变色。结果如中插彩版图1所示。光镜下，正常组小鼠肝细胞正常，肝索排列整齐，肝小叶结构正常。高脂组4周，脂肪变性的肝细胞占2/3以上，呈鱼网状，8周可见气泡样变与凋亡的肝细胞，炎性细胞浸润。复合组4周时，脂肪变性的肝细胞占2/3以上，有炎性细胞浸润。8周时，有炎性细胞浸润灶，出现纤维化和大量气泡样变的肝细胞。油红O染色可见，8周时高脂组比复合组小鼠肝脏的橘红色脂滴广泛，复合组中肝脏的肝窦扩张。见中插彩版图2～9。

2.3 血液生化指标 4周时，高脂组和复合组血清中TG和T－CHO水平均显著高于对照组。8周时高脂组TG含量又显著高于复合组（P＜0.05）。4周时，高脂组和复合组小鼠血清中的转氨酶明显升高，其中GPT水平均显著高于对照组，且保持较平稳的高水平。复合组中GOT、GGT水平与高脂组也有显著差异（P＜0.05）。见表2。

表2 小鼠血清中 GPT、GOT、GGT、TG和T－CHO比较

3 讨论

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是指除过量饮酒和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过量沉积，是一类获得性的代谢应激相关性肝病。为深入研究非酒精性脂肪肝的发病机制，建立一个与人类病变相似的动物模型极为重要。目前国内外主要采用高脂饲喂Wistar或SD大鼠，或是胆碱－蛋氨酸缺乏饮食（MCD）C57BL/6J小鼠模型。前者炎症的产生和造模时间较长，后者可以较快复制模型，但模型中血清TG和肝指数下降，且由于缺少胆碱和蛋氨酸成分，不符合人类实际的饮食情况［3－4］。人类生活中高脂饮食是导致非酒精性脂肪肝主要因素，而使用的一些药物或是摄入的毒性物质也在损伤肝脏［5］。本试验采用高脂饮食和复合诱导两种造模方法。

试验中高脂组和复合组肝指数显著高于正常组。考虑到高脂饲料较油腻，小鼠采食量下降，所以体重下降。相比体重的变化，其肝指数的变化更有意义。试验中小鼠没有表现肥胖症状，但有相关文献报道，人类体重正常时也存在发生NAFLD［6］。试验中病理组织检验结果，经判定符合建模标准［2］。高脂组在4周时，已形成明显的脂肪变性，在8周时有少量炎性细胞。由于四氯化碳的作用，复合组较高脂组有明显的炎性浸润，且肝脏损伤明显。并且两组中胆囊出现不同程度变化，出现炎症。胆囊炎和胆结石在非酒精性脂肪肝病也时常发生［7］。

高脂组与复合组TG含量不稳定，总体呈升高趋势。8周时，高脂组显著高于复合组。高脂组与复合组T－CHO含量都明显高于正常组，且在4～8周较稳定。两组造模结果符合NAFLD中的高脂血症。试验中给予高脂饲料的小鼠TG与T－CHO呈上升趋势，这与NAFLD患者中甘油三酯（TG）、总胆固醇（T－CHO）水平明显高于对照组的文献报道相符［8］。

试验4～8周高脂组和复合组GPT含量明显高于正常组，符合建模标准［2］。血清GPT升高是反映肝脏损伤的标志之一，在GPT、GOT及GGT等肝酶中，GPT与肝脏脂肪聚集关系最为密切，并且文献报道GPT的升高可能会早于NAFLD［9］。复合组的GOT含量较高脂组要高，且在8周时，显著高于高脂组。这与肝细胞损伤程度有关。文献报道，血清GOT增高与NAFLD的进展性肝纤维化相关［6］。可见CCl4在诱导过程中，促进了肝损伤和纤维化的进程，也证实了外界的毒性物质促进非酒精性脂肪肝的发展。模型组中血清酶学指标的升高与文献报道的结果一致，符合日常检测的NAFLD患者血清酶学指标［8、10］。

本试验在考虑高脂饲料与化学性物质作用的因素下，结合以上各种分析，高脂组在高脂诱导4周后，得到的模型已符合人体NAFLD的主要特征。且得到的生化指标可作为进一步研究的参考。复合组中合用了化学性诱导物质，主要考虑实际生活中，人们不可避免地会接触到各种化学毒性物质。四氯化碳可促使肝脏的炎症和纤维化，与高脂合用对非酒精性脂肪肝疾病进程有促进作用。复合组8周可以考虑作为NAFLD的肝脏纤维化病变模型。研究结果为进一步研究发病机制及有效防止药物奠定了基础。

［1］ Weston S R，Leyden W，Murphy，etal.Racial and ethnic distribution of nonalcoholic fatty liver in persons with newly diagnosed chronic liver disease［J］.Hepatology，2005，41：372－379.

［2］ 中华肝病学会脂肪肝和酒精性肝病学组.非酒精性脂肪性肝病诊疗指南（2010年修订版）［J］.中华肝脏病杂志，2010，18（3）：163－166.

［3］ 周光德，赵景民.非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）病理学评价、无创性诊断指标筛选、发病机制及药物干预研究 ［D］.北京：中国人民解放军军事医学科学院，2007：5.

［4］ 刘俊平，范竹萍.从新视角评价非酒精性脂肪性肝炎动物模型［J］.胃肠病学，2008，13（8）：502－504.

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［6］ 荀运浩，施军平，胡晨波，等.血清AST水平与非酒精性脂肪性肝病的进展性肝纤维化有关［J］.肝脏，2010，15（3）：160－163.

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［8］ Mofrad P，Contos M J，Haque M，etal.Clinical and Histologic Spectrum of Nonalcoholic Fatty Liver Disease Associated With Normal ALT Values［J］.Hepatology，2003，6（37）：1286－1292.

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［10］王兰，厉有名.非酒精性脂肪性肝病机制及标志物的蛋白质组学研究 ［D］.杭州：浙江大学，2009：5.