田 野，苏丹萍，钟 望，张显浩，张海明，陈瑞爱,，贺东生*

（1.华南农业大学兽医学院 广东省人畜共患病重点实验室，广州 510642；2.广东大华农动物保健品股份有限公司，广东 新兴 527400）

猪流行性腹泻属于冠状病毒成员，为有囊膜的单股正链RNA 病毒，以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病[1]。在1971 年比利时和英国，该病毒被首次报道，之后在很多养猪国家都暴发了该病，特别是欧洲和亚洲[2]。我国从1976 年开始陆续有PED 的报道,20世纪80 年代后该病在中国流行面逐渐扩大,并多与猪传染性胃肠炎、轮状病毒等其他肠道病原混合感染,给养猪业造成严重经济损失[3]。

近几年我国的广东、广西、江西、湖南、福建、浙江、安徽、江苏、湖北、河北和山东、东北等省（自治区）的部分地区，泰国、菲律宾、韩国等亚洲国家的规模化猪场发生严重的腹泻病例。在我国2011 年和2012 年形成两波猪腹泻病大流行。仔猪腹泻的病原是复杂多样的，根据对18 个大型猪场的抽样检验，发现2012 年猪腹泻主要病原是猪流行性腹泻病毒。分离病毒，并建立稳定的检测手段，是能更好地防控和研究该病毒的基础。

1 材料与方法

1.1 病料、试剂盒载体

2012 年2 月份，从华南地区某大型猪场采集疑似猪流行性腹泻病料-小肠和肛拭纸。病毒RNA 的提取用经典的Trizol 法。MLV、RRI、dNTPs、rTaq购自广州瑞真生物技术有限公司。

1.2 引物的设计与合成

根据Genbank 上登录的CV777 序列设计了1 对针对M 基因的特异性引物，Pm1：5'-TGCTTCAGTATGGC CATTACAAGTACTCTG-3'，Pm2：5'-CCTGTCGGCCCATCACAGAAG

TAGT-3'，用于检测PEDV。以上引物采用PrimerSelect 5.0 软件设计，由Invitrogen 上海生物技术有限公司合成。

1.3 组织病料PEDV 的RT-PCR检测及病毒分离

取少量小肠病料，加入1 mol 双抗，用研磨器进行研磨。将研磨好的组织悬液放入干净的1.5 mL 离心管中，反复冻融3 次，5 000 r/min 离心3 min。去250μL 病料上清用Trizol 法抽提组织总RNA。根据MLV 的说明，取1μLRNA进行反转录，之后产生的cDNA 进行PCR 检测。PCR 反应体系为：10×PCR缓冲液2.5μL、25μmol/L Pm1 1μL、25μmol/L Pm2 1μL、10 mmol/L dNTP Mix 4μL、rTaq 0.25μL， 灭菌ddH2O 补足至25μL。PCR 反应程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 个 循 环，最后72 ℃延 伸10 min。PCR 产 物 用10 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测。

将阳性病料反复冻融3 次，过滤膜，接种到vero 细胞，吸附2 h。弃掉毒液，加入含55μg/mL 的DMEM（不含血清），培养72 h，收毒。用同样的方法，传到第15 代时细胞出现明显的病变。

1.4 RT-PCR 方法特异性的检测

选取临床上有腹泻症状的其他病毒，如猪传染性胃肠炎、轮状病毒、猪瘟、伪狂犬病病毒等，检测该RT-PCR 方法的特异性。

2 结果与分析

2.1 细胞病变

病毒在接种vero 细胞前，先与含终浓度55μg/mL 胰蛋白酶的无血清DMEM 作用几分钟，然后接种到vero细胞上，加入含终浓度45μg/mL 胰蛋白酶的无血清DMEM 维持液，72 h 后收取病毒液。在前10 代细胞病变不明显，随着代数的增多细胞病变逐渐典型。连续传代至第15 代，在vero 细胞上出现典型的空泡状病变（如图1）。且传代后PCR 可以检测到病毒（如图2）。

图1 第15 代PEDV 出现空泡状的细胞病变

2.2 RT-PCR 方法特异性检测

根据临床症状很难区分猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和轮状病毒，因为它们主要病变都是使肠壁变薄，从而引起消化不良性的腹泻。PCR 方法优点就是特异性好，能够区分不同的病原。为了检测RT-PCR 的特异性，选取4种临床上能出现腹泻症状的病毒（猪传染性胃肠炎、轮状病毒、猪瘟病毒和伪狂犬病病毒），做PCR 检测，结果RT-PCR 的特异性高（如图3）。

2.3 细胞毒不同代次的检测

分离猪流行性腹泻病毒很困难，它很难在现有的传代细胞上出现细胞病变，病毒需要胰蛋白酶的作用才能侵入细胞。在分离病毒前几代不会出现细胞病变，通过PCR 检测成了确认病毒存在的主要手段。

猪流行性腹泻病毒是近几年造成仔猪腹泻的主要病原之一。由于病毒很难在现有的细胞系中增殖和出现细胞病变，病毒分离很难，从而对它的研究比较滞后。能成功的分离该病毒，为研究它提供了基础作用。另一方面在临床上造成腹泻的病原较多，建立一个稳定成熟的PCR 方法成了当务之急。猪流行性腹泻病毒的M 基因非常保守，针对M 基因设计了一对引物，通过检测可知，PCR 方法特异性非常好。

[1] Pensaert M B, Debouck P. A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine[J]. Arch Virol,1978,58(3):243-247.

[2] Kweon C H , Kwon B J, Jung T S, et al.Korean J Vet Rec 33[M].1993:249-254.

[3] 倪艳秀, 林继煌, 何孔旺, 等. 猪流行性腹泻研究概况[J].畜牧与兽医,2001, 33(1): 38-40.