佟苏东 史国辉 卢海源 河北省唐山市丰南区医院内五科（唐山063300）

△河北联合大学附属医院肾内科（唐山063009）

急性肾损伤（Acute Kidney Injury，AKI）是危重患者常见的临床并发症之一，其危害大，病死率高，可作为一项独立危险因素影响患者预后。AKI的病因是多因素的，但由脓毒症（sepsis）引起者居高不下。回顾过去，尽管在治疗和研究技术方面取得了许多进步，但是对于脓毒症相关AKI患者的预后没有实质性改变，其病死率仍在不断增长！原因可能与我们对脓毒症相关急性肾损伤的发病机制了解不够，近年来一些人提出氧化应激反应在急性肾损伤中起重要作用，并参与整个过程。认为氧化应激诱导的肾小管功能障碍也是AKI的一个重要机制。本研究利用盲肠结扎穿孔（Cecal Ligation and Puncture，CLP）法复制大鼠脓毒症致AKI模型，应用苦碟子进行药物干预。比色法检测肾功能及血清SOD、MDA改变，组织病理学观察肾脏组织形态学变化；探讨氧化应激反应在脓毒性肾损伤中的作用及苦碟子进行药物干预的影响，为临床诊治脓毒性急性肾损伤提供新的诊断思路和方法。

1 材料与方法1.1 材 料 48只健康雄性SD（Sprague－Dawle）大鼠，2月龄，平均体重250±20g，由河北联合大学实验动物中心提供。丙二醛（mal0ndialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方 法 1.2.1 按 CLP法［1］制备大鼠脓毒症模型并随机分组；①空白对照组（Normal group，n＝12）：不给予任何处理，通过取眼球法采血，随后直接处死；②假手术组（Sham group，n＝12，A组）：SD大鼠术前12h禁食，75%酒精消毒，10%水合氯醛3mL/kg腹腔内注射麻醉，腹部中线切口3cm，开腹后显露盲肠，翻动肠管，牵拉盲肠，关腹，不结扎和穿孔盲肠。③盲肠结扎穿孔组（CLP group，n＝12，B组）：SD大鼠术前12h禁食，75%酒精消毒，10%水合氯醛3mL/kg腹腔内注射麻醉，腹部中线切口3cm，开腹后显露盲肠，在其根部用3—0号丝线结扎并用18G针头贯穿盲肠2次，挤出少许肠内容物后将肠管送入腹腔，然后逐层关腹，并于术后给予灭菌注射用水10mg/Kg一次性腹腔注射。④苦碟子干预组（CLP＋苦碟子组，n＝12，C组），手术同③，术后给以苦碟子10mL/Kg腹腔注射干预。各组在术后3h、6h、24h分别抽取4只通过取眼球法采血、并处死。在各个时间点采集血清及大鼠肾脏组织标本。

1.2.2 血清肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）含量测定：采取眼底静脉丛取血，用内径粗一些的毛细管，切成1.5～2cm的长度，先用肝素润一下，不用麻醉直接单手固定大鼠，另一只手把毛细管从眼角插入，取血约1mL，倒入离心管中，常温放置30min，离心3000转/min，10min。取血清上生化自动分析仪及配套试剂盒检测血清肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）含量。

1.2.3 肾脏组织匀浆中MDA含量及SOD活性的测定：各组大鼠取左侧肾脏－80℃保存，待所有动物实验结束后，将肾脏组织制成10%生理盐水匀浆，4℃下3000r/min离心10 min，取上清，考马斯亮蓝蛋白测定法检测肾脏组织匀浆液中蛋白浓度，按试剂盒操作说明，分别检测MDA含量及SOD活性。

1.2.4 肾脏病理学检测：新鲜右侧肾脏经10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，HE染色，显微镜下观察。

1.2.5 统计学分析：所有计量资料数据应用均数±标准差（±s）表示，对各组资料以SPSS13.0统计软件处理，组间比较应用单 因素方差分析（one－way ANOVA）及最小显著差法（LSD），使用Pearson相关性分析分析参数之间的相关性。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果2.1 各组肾脏组织病理学改变 光镜下见：A组无明显病理改变，各结构间界限清楚，肾小管上皮正常无明显损伤，偶可见肾小管上皮细胞再生、脱落，无细胞的坏死现象。B组可见肾小球萎缩，球囊扩张，肾小管内皮肿胀、充血、出血，广泛空泡变性；C组较B组病理明显减轻。

2.2 不同时间点血清中肌酐的检测 CLP术对大鼠血清肌酐的影响及苦碟子的作用：3组大鼠在术后0h，血清肌酐差异无统计学意义（P＞0.05）；与A组相比，B组在术后3h的血清肌酐值开始上升，24h仍持续升高，差异有统计学意义（P＜0.05），而C组在大鼠术后3h、6h、24h血肌酐升高情况较B组显著减轻，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠各时间点血肌酐指标变化（umol/L±s）

表1 各组大鼠各时间点血肌酐指标变化（umol/L±s）

注：与 A组比较后，△P＜0.05；与B组比较后，▲P＜0.05

时间（h）组 别 n 0h 3h 6h 24h A组 12 22.88±2.76 25.50±2.42 30.50±3.62 40.00±6.63 B组 12 23.4±2.87 42.17±3.18△ 55.5±6.11△ 106.15±13.17△C组 12 23.89±2.71 37.84±4.55▲ 39.02±5.07▲ 63.02±11.61▲

2.3 各组大鼠各时间点肾组织匀浆中MDA、SOD的比较与A组比较，B组、C组大鼠CLP手术后3h、6h、24h肾组织MDA含量均显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与B两组比较，C组明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。

与A组相比，B组、C组肾脏组织中SOD活力明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；C组SOD虽明显低于A组，但与与B组比较，SOD水平有明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠肾组织匀浆中MDA、SOD的比较（n＝12，±s）

表2 各组大鼠肾组织匀浆中MDA、SOD的比较（n＝12，±s）

注：与 A组比较后，△P＜0.05；与B组比较后，▲P＜0.05

指标 T（h）A组 B组 C组3 0.99±0.13 1.25±0.21△ 1.09±0.15▲MDA 6 1.02±0.12 1.45±0.13△ 1.16±0.14▲（nmol/mgprot）24 1.06±0.15 1.86±0.13△ 1.32±0.13▲SOD（U/mgprot）3 6 2 4 15.77±1.20 16.32±1.6 16.87±2.08 11.09±1.13△10.55±1.55△8.21±1.55△13.99±2.21▲14.66±2.23▲13.41±1.91▲

3 讨 论脓毒症是感染引起的全身炎症反应综合征（SIRS），严重者可引起脓毒症休克（septic shock），甚至多器官功能障碍综合征（MODS）。脓毒症休克也称感染性休克，是由革兰阴性或阳性细菌、立克次体、霉菌、病毒等病原微生物及其毒素等产物引起的人体有效循环血量急剧减少，组织血液灌注严重不足从而导致全身各重要器官和细胞的功能代谢障碍及结构损害的一种急危重症。肾脏是脓毒症和脓毒症休克最易受累的器官之一，AKI又是影响脓毒症和脓毒症休克患者疾病发生发展和预后的重要因素。脓毒症（sepsiS）并发急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是指脓毒症患者发生急性肾实质损伤，同时排除其他导致肾脏损害的因素（如肾脏缺血、肾毒性物质等）。在脓毒症人群中AKI发生并不少见，发生率随着脓毒症的严重度上升而增加。近年来，脓毒症合并AKI治疗方面有较多进展，改善了该人群的预后。脓毒症时，肾脏的内皮细胞不仅被激活，产生炎性因子；同时也是炎性因子首要攻击的靶细胞之一［2］。在临床实践中发现，脓毒症一旦合并肾脏损害，治疗难度明显增加。内毒素血症ARF早期血管收缩可能与氧自由基有关，内源性活性氧簇清除剂可减轻活性氧簇引起的肾小管和肾血管的损伤。氧自由基与NO作用产生有害的过氧化亚硝酸盐，脓毒症氧化相关的内皮损害也是ARF的原因之一［3］。

本研究结果显示：B组肾脏病理可见肾小球萎缩，球囊扩张，肾小管内皮肿胀、充血、出血，肾小管广泛空泡化，Cr、BUN和肾组织中的MDA明显升高，且MDA与Cr、BUN两者呈显著正相关。说明脓毒症发生发展过程中，肾脏存在着由氧化应激反应引起的氧化损伤。而且，氧化损伤是肾功能损害的主要原因。脓毒症时机体会产生大量的羟基（OH－），生成的OH－是最有害的自由基，会对机体造成氧化损伤［4］。

氧化应激（Oxidative Stress，OS）是指机体在遭受各种有害刺激时，体内氧化与抗氧化作用失衡，体内高活性分子如活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）和活性氮自由基（reactive nitrogen species，RNS）产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物，从而导致组织损伤。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。郭德玉等［5］认为氧自由基是内毒素血症大鼠肾损伤的重要原因。近年研究发现，重度脓毒症病人的器官功能障碍主要是功能性而非器质性的，是由于其线粒体功能障碍而致组织氧耗量降低［6－7］，使组织细胞进入乏氧代谢的过程，继而导致细胞代谢障碍。吕杰等［8］研究了重度脓毒症患者应用中药抗氧化剂可使氧供、氧耗和乳酸清除率得到明显提高，组织氧代谢显著改善。

我国目前尚缺乏脓毒症、AKI相关临床统计资料。结合我国中医特色，制定了中医学对脓毒症AKI的认识及中西医结合防治策略，在对脓毒症、脓毒症AKI等的治疗方面积累了丰富经验。朱雪琦等［9］在查阅大量文献和临床实践的基础上，提出脓毒症AKI的中医防治策略：早期运用“活血化瘀”法，可以在一定程度上防治脓毒症AKI的发生和阻断其进展。

苦碟子，学名抱茎苦荬菜，为菊科苦荬菜属植物。研究认为，苦碟子的主要活性成分腺苷（Adenosine）及类似物，是一种ADP受体抑制剂，具有抗血小板聚集作用，可降低全血黏度、纤维蛋白原并改善管襻流态和襻周状态；同时腺苷具有明显的扩张血管作用，能有效改善缺血缺氧，使组织器官的功能得到好转。有研究证实，苦碟子对早期肾病肾小球具有保护作用，对微量白蛋白尿有减轻和预防作用［10－12］。文献报道，Lu J等［13］在细胞水平也证实从苦碟子中提取的6种类黄酮成分均可抑制过氧化物的产生，可明显减轻脓毒症大鼠的氧化应激反应，有明显的抗氧化损伤作用，对肾脏起到保护作用，可显著降低血清Cr，减轻肾组织炎细胞浸润、肾小球淤血和肾小管上皮细胞损伤。

综上所述，脓毒症可以引起急性肾损伤，并随着病程延长加重肾脏损害，通过测定脓毒症大鼠肾组织MDA含量及肾脏组织中SOD活力及肌酐变化来观察氧化应激在脓毒性肾损伤的作用，说明脓毒症时存在着显著的脂质过氧化现象，而清除氧自由基的能力则明显不足。苦碟子注射液可显著抑制脂质过氧化并提高其清除氧自由基的能力，对脓毒症时组织氧自由基损伤的保护作用，有助于氧化应激状态的恢复，从而纠正脓毒症的病理生理状态，为脓毒症的治疗提供了新的途径，对脓毒症急性肾损伤的氧化应激作用及中西医结合临床研究进行思考，为脓毒症急性肾损伤的防治提供新的思路。但本研究尚未涉及脓毒症模型大鼠的最终预后，且本研究结果的深层次分子生物学机理亦不清楚，尚需进一步深入研究。

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