赵粉琴，谢知慧，曹 胜，牟慧琴

(1．甘肃中医学院中西医结合妇科教研室，甘肃 兰州730000;2．甘肃中医学院中医医疗系妇科教研室，甘肃 兰州730000;3．甘肃中医学院中医基础教研室，甘肃 兰州730000)

骨质疏松症是围绝经期妇女的常见病、多发病。随着老龄化社会的到来，骨质疏松症发病率成逐年上升趋势。中医学认为该病主要是七七之年肾气衰退，肾精亏虚，肝血不足，筋骨失于濡养所致。围绝经期女性由于卵巢功能衰退，雌激素水平急剧下降，骨的形成减少、吸收亢进，导致骨量丢失加速，而造成骨质疏松。导师牟惠琴教授通过长期临床经验、本着“补肾健脾，阴阳互治”的原则而研制出治疗绝经前后诸证的经验方药延经丸。为进一步完善延经丸防治围绝经期骨质疏松的作用机制，本课题在前期研究的基础上，运用生物免疫技术，从细胞因子水平来探讨延经丸的作用机制，为临床治疗本病提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 动 物

6 月龄SPF 级Spragne-Dawley 雌性大鼠，体质量(200±20) g，由甘肃中医学院实验动物中心提供，实验动物许可证号:SYXK(甘)2004－0006。

1．2 药品、试剂与仪器

延经丸，由生地黄、熟地黄、菟丝子、紫河车、阿胶、枸杞子、白术、巴戟天、鹿角霜、山药等组成，由甘肃中医学院附属医院提供，每袋含生药20 g;9 g/L 生理盐水，西安京西双鹤药业有限公司产品，批号090524471;尼尔雌醇片，2 mg/片，北京四环制药有限公司产品，批号20081101。雌二醇放射免疫试剂盒，天津新湾生物科技有限公司提供，批号20091201;白细胞介素1(IL-1) 放射免疫试剂盒(批号20090215)和白细胞介素－6(IL-6)放射免疫试剂盒(批号20091011)，由北京北方生物技术研究所提供。BS110S 型电子称及051105 型电子分析天平，均为北京赛多利斯公司产品;KDC－2044 型低速冷冻离心机和GC－911 型放射免疫计数器，科大创新股份有限公司中佳分公司产品;722 型22s 分光光度计，上海精密科学仪器有限公司产品;RM2135 型石蜡切片机、Primo 型电动高速离心机及CX31－32L02 型光学显微镜，德国kendro 公司产品;TEC－VEM－J2 型石蜡包埋机及VIP－5Jr－J2 型石蜡脱水机，日本奥林巴斯公司产品。

1．3 模型的建立与分组

大鼠适应性饲养1 周后，按文献法［1］进行造模，100 g/L 水合氯醛5 μL/g 腹腔注射麻醉，取下腹部正中纵行切口(约1．5 cm)，切开皮肤，逐层分离皮下组织及肌肉筋膜进入腹腔，于双侧肾下极处找到卵巢(粉红色颗粒状)，结扎并切除双侧卵巢，分层缝合肌肉、皮肤。假手术组手术路径同手术组，但仅切除双侧卵巢旁各一块脂肪组织。术后肌注青霉素1 次(8 万U/只)，以预防感染。手术过程顺利，未见大鼠死亡。摘除卵巢后5 d，逐只进行阴道涂片检查，1 次/d，连续5 d，以通过阴道脱落细胞检查证明去势成功。实验组和对照组均采用普通饲料喂养。

将造模成功的48 只大鼠按随机数字表法分为模型对照组，尼尔雌醇组，延经丸高、低剂量组4 组，每组12 只。另设假手术组12 只。

1．4 给药方法

各组均在术后第7 天开始灌胃给药。按人和实验动物体表面积比计算动物等效给药量。尼尔雌醇组给予尼尔雌醇1 μg/g(相当于成人日临床用量2 mg/60 kg 体质量的10 倍)灌胃，使用前配成混悬液(浓度为0．167 g/L)，1 次/周。延经丸给药高、低剂量依次给予1．8，0．45 mg/ g (依次相当于成人日临床用量6，1．5 倍)，以蒸馏水配成180 g/L 和45 g/L，灌胃给药，1 d 1 次。用药组灌胃10 μL/(g·d)相应药液，假手术组和模型对照组灌胃等体积蒸馏水。连续给药4 周。

1．5 标本采集与处理

末次给药24 h 后，100 g/L 水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉采血8 h 内分离血清，按照参考文献［2］进行血液处理，样品置冰箱待测。实验方法按照参考文献［2］进行。处死大鼠，取第4 腰椎，剔除肌肉组织;置于100 g/L 福尔马林溶液中固定24 h;在甲酸中浸泡至完全脱钙;经乙醇脱水，石蜡包埋，沿矢状面切开，切片厚度5 μm，常规HE 染色。

1．6 检测指标

血清激素和细胞因子水平测定:采用放射免疫方法测定血清E2、IL-1 和IL-6 水平，操作步骤根据试剂盒说明书。骨质组织测定:光镜下观察骨组织结构。

1．7 统计学方法

采用SPSS 17．0 统计分析软件处理。数据以均数() ± 标准差(s)表示，采用单因素方差分析(ANOVA)分析，采用LSD 法进行组间两两比较。以P＜0．05 为差别有统计学意义。

2 结 果

2．1 各组大鼠血清E2、IL-1 和IL-6 水平对比

与假手术组对比，模型对照组血清E2水平降低，IL-1 和IL-6 水平增高，差别有统计学意义(P＜0．01)，说明成功复制大鼠雌激素低落骨质疏松模型。与模型对照组对比，尼尔雌醇组及延经丸高、低剂量组的血清E2水平升高、IL-6 水平下降(P＜0．05或P＜0．01))，而IL-1 水平虽下降，但差别无统计学意义(P＞0．01)。延经丸两剂量组血清E2、IL-6 和IL-1 水平与尼尔雌醇组对比，差别均无统计学意义(P＞0．05)。延经丸两剂量组间3 个指标对比，差别亦无统计学意义(P＞0．05)。结果表明:延经丸高、低剂量的作用与尼尔雌醇相当;各治疗组体内雌激素水平上升缓慢，不能达到未绝经前的水平。见表1。

表1 各组大鼠血清E2、IL-1 和IL-6 水平对比 ±s

表1 各组大鼠血清E2、IL-1 和IL-6 水平对比 ±s

注:与模型对照组对比，* P ＜0．05，＊＊ P ＜0．01。灌胃给药时有5 只大鼠死亡。

组 别 动物数 E2/(ng·L －1) IL-1/(μg·L －1) IL-6/(μg·L －1)假手术组 11 13．57 ±11．22＊＊ 0．08 ±0．02＊＊ 55．28 ±20．32＊＊模型对照组 12 2．66 ±0．98 0．12 ±0．04 109．51 ±34．77尼尔雌醇组 10 5．47 ±1．83* 0．10 ±0．04 74．15 ±13．52＊＊延经丸高剂量组 10 6．8 ±10．25* 0．09 ±0．04 65．76 ±24．09＊＊延经丸低剂量组 12 4．56 ±7．96* 0．09 ±0．04 66．69 ±37．10＊＊

2．2 各组大鼠骨组织形态学观察

第4 腰椎骨组织切片显示:模型对照组大鼠骨小梁明显变细、数目减少、排列稀疏，骨小梁间距增大，网状结构缺如，呈典型的骨质疏松改变，说明造模成功。假手术组大鼠骨小梁丰富、连续、致密。各治疗组与模型对照组相比，骨小梁明显多于模型对照组，排列较整齐，网状结构相对完整。见图1。

图1 各组大鼠第4 腰椎骨骨质病理观察(HE×10)

3 讨 论

围绝经期和绝经后期骨质疏松的特点是伴随绝经的骨量加速丢失。围绝经期和绝经后期雌激素水平下降，肝、肾合成活性维生素D 的功能下降，导致肠钙吸收下降;此外，雌激素水平下降，使甲状旁腺激素活性增加，从而使破骨细胞活跃，骨吸收增加，骨转换加快，导致骨量的快速丢失，造成骨小梁变细，骨皮质结构破坏并渐进性变薄，骨强度下降［3］，因此，雌激素缺乏是围绝经期和绝经后期骨质疏松的主要病理基础。大量的研究表明: IL-1、IL-6 是强有力的骨吸收刺激因子［4－6］，在绝经后骨质疏松发生过程中起着非常重要的作用。在正常情况下，雌激素除了本身对骨吸收有抑制作用外，还对IL-1、IL-6 等骨吸收刺激因子也有一定的抑制作用，从而使骨吸收与骨形成维持在相对的平衡状态，使骨进行着正常的代谢。雌激素缺乏可使这些抑制遭到一定程度的解除，使IL-1、IL-6 等骨吸收刺激因子的活性异常增高，由此造成骨的过度吸收，骨量的大量丢失，进而导致骨质疏松的发生。

中医学认为本病的发生以肾虚为主要因素，并与肝脾、气血相关，治疗上以补肾为主。

牟慧琴教授根据多年的临床经验认为:肾虚是绝经后骨质疏松症发病的关键，脾胃虚弱与肝血不足是本病发生的基础。延经丸中以生地黄、熟地黄、鹿角霜、枸杞子、巴戟天、菟丝子和紫河车补肾壮阳，益精生髓，阴阳双补，符合肾藏精，寓水火与一脏的理论;枸杞子、阿胶补养肝血;白术、山药健脾益气，以补后天之气，提高人体消化吸收的能力。该组方从多脏腑补益调节着手，以补肾阴为主，阴阳并补，健脾益气为辅，先天与后天相辅相成，体现了中医的整体观念的思想。根据肝肾同源，精血同源的理论，肾精充足，肝血有藏，骨髓得养，骨质则强健。

本研究显示:延经丸可增高去卵巢骨质疏松模型大鼠血清E2水平，从而增加骨质吸收，减少骨质破坏;同时可使IL-1、IL-6 的表达减少、活性降低，从而使两者介导的破骨细胞分化增殖功能减弱，骨吸收减少。

［1］王晓，梅其炳，刘莉，等．骨质疏松动物模型的复制与评价［J］．中国骨质疏松杂志，2007，13(2):141－145．

［2］金珉廷，郑洪新．中医肾藏精生髓主骨理论与骨质疏松症［J］．辽宁中医药大学学报，2009，11(3):35－36．

［3］Meczekalski B，Czyzyk A．New forms of estrogenotherapy in postmenopausal osteoporosis［J］．Pol Merkur Lekarski，2009;27(157):77－80．

［4］Kimble RB，Vannice JL，Bloedow DC，et al．Interleukin-1 receptor antagonist decreases bone loss and bone resorption in ovariectomized rats［J］．J Clin Invest，1994，93(5):1959－1967．

［5］Jilka RL，Hangoc G，Girasole G，et al．Increased osteoclast development after estrogen loss: mediation by interleukin-6［J］．Science，1992，257(5066):88－91．

［6］Manolagas SC，Jilka RL．Cytokines，hematopoiesis osteoclastogenesis and estrogens［J］．Calcif Tissue Int，1992，50(3):199－202．