高秀艳，宋士军，崔 同，王腾腾，李朝苹，田 粟#

1)河北医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 石家庄 050017 2)河北医科大学基础医学院生理学教研室 石家庄 050017 3)河北农业大学食品科技学院 保定 071001

随着人口的老龄化以及现代人生活习惯的改变，人群疾病模式已由传染性疾病转变到以慢性病为主，其中心血管疾病是威胁人类健康的最常见的慢性疾病，而长期高血压是心血管疾病死亡的重要原因。目前的研究认为改变生活习惯和药物治疗是预防和治疗高血压的有效方法。日常饮食中蔬菜、水果、红酒、茶等[1-2]被证明能较好地预防和控制高血压，其降压作用主要归功于其中的多酚类化合物。多酚类化合物主要包括类黄酮和酚酸，其降血压的机制是通过降低血管的氧化压力[3]和舒张血管[1]实现的。目前国内对多酚类化合物舒张血管作用的研究多聚焦于中草药的粗提物[4-7]，有关某一具体活性成分对血管舒张作用的报道还尚少见。阿魏酸(ferulic acid，FA)是植物中普遍存在的一种酚酸，因其具有较强的抗氧化活性而被广泛应用于医药、化妆品、保健品等行业。近年来，通过大量的体内和体外实验研究[8-10]发现FA及其衍生物具有抗血栓、降血脂、消炎、防癌等生物活性。该研究评价了FA对大鼠离体胸主动脉环的舒张作用，并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1药品、试剂及实验仪器去氧肾上腺素(L-phenylephrine hydrochloride，PE)、氯化乙酰胆碱(acetylcholine chloride，ACH)、L-亚硝基精氨酸甲基酯(NG-nitro-L-arginine methylester，L-NAME)、吲哚美辛(indomethacin，Indo)、格列苯脲(glibenclamide，Gli)、四乙基胺(tetraethylammonium，TEA)、二甲基亚砜(DMSO)、FA均购自美国Sigma公司；亚甲蓝(methylene blue，MB)、维拉帕米购自美国ACROS公司；Krebs-henseleit (K-H)液由NaCl 118.00、KCl 4.70、CaCl22.52、MgSO4·7H2O 1.40、NaHCO324.20、KH2PO41.18 和葡萄糖11.00 mmol/L组成，均购自天津博迪化工股份有限公司。SQG-4四腔器官浴槽系统、HSS-1(B)型恒温水浴槽、BL-420E+生物机能实验系统(成都仪器厂)；Sartorius CP124S电子天平(德国赛多利斯公司)。

1.2胸主动脉环的制备

1.2.1 胸主动脉环的制备与稳定 清洁级Wistar大鼠，220～270 g，雄性，由河北医科大学实验动物中心提供。大鼠颈椎脱臼处死后，取出胸主动脉，剔除血管周围组织，将其剪成长约3 mm的动脉环，避免过度牵拉及损伤致动脉失活。置于通以体积分数95%O2+体积分数5%CO2混合气体的K-H液中，一端通过挂环固定，另一端经张力换能器与生物机能实验系统相连，保持37 ℃恒温，调节静息张力至1 g，稳定平衡40 min，期间每隔20 min换液1次。

1.2.2 血管内皮活性和完整性检测 待动脉环稳定后，向浴槽中加入10 mmol/L PE，动脉收缩张力≥300 mg，判断为有活性。当动脉环收缩达到平台(约10 min)后，加入10 mmol/L ACH，收缩的血管舒张≥70%时，可认为血管内皮完整，反之，则认为已去内皮处理(即用铁丝穿过血管腔，对血管内表面进行摩擦)。检测完毕后用K-H液连续冲洗浴槽3次，去除PE 和ACH的影响，稳定动脉环，待基线平稳后，开始以下实验。

1.2.3 血管张力 以加入药物后的血管张力变化幅度与PE诱发最大收缩幅度之间的比率×100%反映血管张力的变化。

1.3FA对PE、KCl预收缩的大鼠离体胸主动脉环的舒张作用使用内皮完整或去内皮的动脉环，向浴槽中分别加入10 mmol/L PE、60 mmol/L KCl，收缩达到平台后累积加入FA至0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mmol/L，加药间隔为7 min，记录张力变化。每组均取8个动脉环。

1.4L-NAME、Indo、MB、Gli、TEA、维拉帕米对FA舒张大鼠离体胸主动脉环作用的影响取内皮完整动脉环，向浴槽中分别加入100 μmol/L L-NAME、10 μmol/L Indo、10 μmol/L MB、10 μmol/L Gli、10 μmol/L TEA、1 μmol/L 维拉帕米预处理20 min后，加入PE预收缩动脉环，待平衡后分别加入终浓度为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mmol/L的FA，记录张力变化，加药间隔7 min。每组均取8个动脉环。

1.5FA对平滑肌细胞外钙内流的影响用无Ca2+的K-H液冲洗动脉环3次，孵育15 min后，分别加入1、4和10 mmol/L FA，15 min后加入10 mmol/L PE，收缩达到平台后，累积加入CaCl2溶液至浴槽中，使Ca2+浓度达到0.01、0.10、1.00、10.00 mmol/L，分别记录张力变化。每组均取8个动脉环。

1.6FA对平滑肌细胞内钙释放的影响用无Ca2+的K-H液冲洗3次后，孵育15 min，记录基础张力并加入10 mmol/L PE达到收缩平衡，张力的变化记为T1；继而用含Ca2+的K-H液冲洗3次，孵育≥40 min，再用无Ca2+的K-H液冲洗3次，孵育15 min，分别加入1、4和10 mmol/L FA，15 min后记录张力并加入10 mmol/L PE达到收缩平台，张力的变化记为T2。T2/T1表示FA对细胞内Ca2+释放的影响。每组均取8个动脉环。

1.7统计学处理半数有效浓度(EC50)的计算用直线回归法，亲和力指数pD2为EC50的对数倒数。采用SPSS 13.0进行分析，两组定量资料的比较用t检验或秩和检验(数据呈正态分布，但方差不齐)，多组间定量资料比较用单因素方差分析或秩和检验(数据呈正态分布，但方差不齐)，组间两两比较用SNK或Dunnet-t检验，FA对细胞外钙的影响采用4×4析因设计的方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1FA对PE、KCl预收缩的大鼠离体胸主动脉环的舒张作用FA对PE预收缩的大鼠离体的内皮完整胸主动脉环张力的影响见图1。FA对PE、KCl预收缩的内皮完整胸主动脉环的舒张效果均有浓度依赖性(表1)。两者的EC50分别为(2.43±0.52)和(2.17±0.15) mmol/L，pD2分别为(2.62±0.08)和(2.66±0.03) mol/L，差异无统计学意义(Z=0.858，P=0.391)。FA对PE预收缩的去内皮胸主动脉环也具有浓度依赖的舒张作用(表1)。其EC50为(2.59±0.62) mmol/L，pD2为(2.60±0.93) mol/L，与PE预收缩的内皮完整组间差异无统计学意义(Z=0.447，P=0.655)。

图1 FA对PE预收缩大鼠离体内皮完整的胸主动脉环张力的影响

表1 FA对PE、KCl预收缩大鼠离体胸主动脉环的舒张作用(n=8) %

E+:内皮完整动脉环;E-：去内皮动脉环。

2.2L-NAME、Indo、MB、Gli、TEA及维拉帕米预处理后FA对舒张大鼠离体胸主动脉环作用的影响

内皮完整动脉环经L-NAME、Indo、MB、Gli、TEA分别预处理后，FA均对PE预收缩的动脉环表现出舒张作用，且随着FA浓度的增加，舒张作用越明显，L-NAME、Indo、MB预处理实验组与内皮完整组的EC50和pD2值(表2)差异无统计学意义(χ2=3.404，P=0.333)。Gli、TEA预处理组与内皮完整组间差异无统计学意义(χ2=0.061，P=0.970)。伴随FA浓度的增加，动脉环收缩率逐渐降低，加入维拉帕米预处理后， EC50为(4.31±1.03)mmol/L，与内皮完整组(2.43±0.52)mmol/L相比差异有统计学意义(t=4.055，P=0.005)，表明维拉帕米明显减弱了FA对PE预收缩动脉环的舒张作用。

表2 L-NAME、Indo、MB、Gli、TEA预处理后FA对PE预收缩大鼠离体胸主动脉环作用的EC50和pD2值(n=8) %

2.3FA对平滑肌细胞外钙内流的影响见表3。随CaCl2溶液浓度的增加，对照组和不同浓度FA组均表现出随之增加的收缩动脉环的作用。

2.4FA对平滑肌细胞内钙释放的影响与对照组(1.02±0.12)相比，1、4和10 mmol/L FA均有明显抑制细胞内钙的作用(0.81±0.10，0.47±0.09，0.13±0.09)(F=108.816，P<0.001)，而且随着FA的浓度的增加，其抑制细胞内钙的作用越明显。

表3 FA对平滑肌细胞外钙内流的影响(n=8) %

FCa2+=68.625，P<0.001；FFA=134.517，P< 0.001；F交互=0.298，P=0.974。

3 讨论

该实验结果显示，在离体条件下，FA可浓度依赖性舒张PE和KCl预收缩的内皮完整的胸主动脉环，提示FA具有一定的舒张血管的作用。将离体动脉环经机械摩擦去掉内皮后，FA舒张血管的作用仍然存在，提示FA舒张血管作用主要是直接作用于血管平滑肌，而非依赖内皮。

有研究[1]表明多酚类化合物舒张血管作用的内皮机制主要是内皮细胞NO合酶作用于L-精氨酸释放NO，继而激活血管平滑肌细胞的可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)，引起环磷酸鸟苷(cGMP)升高，从而产生舒张血管的作用。还可利用内皮-环氧合酶(COX)-前列腺素(PG)-G蛋白途径，使内皮细胞中的COX催化产生PGI2，作用于平滑肌的IP受体，激活G蛋白和腺苷酸环化酶(AC)产生环磷酸腺苷(cAMP)，引起平滑肌的舒张。为了进一步验证FA的非内皮依赖性的血管舒张作用，作者分别使用NO合酶抑制剂L-NAME、GC的抑制剂MB及COX的抑制剂Indo对胸动脉环进行预处理后，评价FA舒张血管的作用。结果表明这3种抑制剂不能阻断FA的舒张血管作用，这与Chen等[11]的研究结果一致。

血管平滑肌的舒张与收缩受Na+、Ca2+、K+等多种离子的调节。其中，钙通道和钾通道是血管平滑肌细胞上最重要的离子通道，二者共同维持着血管张力的平衡。平滑肌存在钙激活钾通道(Kca)、ATP敏感钾通道(KATP)、内向整流钾通道(inward-rectifier K+channels)、延迟整流电压位依赖性钾通道(delayed-rectifier voltage-dependent K+channels)。有研究[12]报道多酚类化合物发挥舒张作用的一个重要机制是开放了钾通道，故作者分别选择了KATP和Kca通道的抑制剂Gli和TEA作用于PE预收缩的内皮完整的胸主动脉环，结果显示Gli和TEA未抑制FA的舒张作用，提示FA对胸主动脉环的舒张作用与钾通道无关。血管平滑肌细胞膜上的钙通道主要有L型和T型，它们直接控制钙离子的内流量，调节细胞的舒缩功能。平滑肌收缩是由内贮钙释放和外钙进入细胞质使钙离子增加所致。该实验观察到，在无Ca2+的K-H液中不同浓度的FA可以剂量依赖性地抑制CaCl2诱导的收缩，证明其可以抑制细胞外钙内流。研究[13]表明,血管平滑肌细胞细胞外的钙离子主要通过L-型钙通道(ICa-L)进入细胞内，当加入ICa-L特异性阻断剂维拉帕米后，FA舒张率较对照组明显降低，推测其舒张血管的机制可能与阻断ICa-L以阻止细胞外钙离子内流有关。在无Ca2+的K-H液中预先孵育不同浓度的FA可降低PE诱发的短暂性血管收缩，表明FA阻断了细胞内钙外流。但是1 mmol/L FA和4 mmol/L FA对外钙内流的抑制作用无差异，而在抑制内钙释放时存在差异，考虑FA发挥舒张血管作用主要与抑制了细胞内钙的释放有关。

[1] Schini-Kerth VB, Auger C, Kim JH, et al. Nutritional improvement of the endothelial control of vascular tone by polyphenols:role of NO and EDHF[J]. Pflugers Arch,2010,459(6):853

[2] Ohkita M, Kiso Y, Matsumura Y. Pharmacology in health foods:improvement of vascular endothelial function by french maritime pine bark extract (Flavangenol) [J]. J Pharmacol Sci,2011,115(4):461

[3] Serafini M, Miglio C, Peluso I, et al. Modulation of plasma non enzimatic antioxidant capacity (NEAC) by plant foods: the role of polyphenols[J]. Curr Top Med Chem,2011,11(14):1821

[4] 庄须国,潘振伟,刘晓丹,等.枳壳醇提物对大鼠离体胸主动脉环的收缩作用与机制[J].中国药理学通报,2008,24(6):810

[5] 王桂芝,罗希锋,孙博,等.篇蓄黄酮苷对大鼠离体胸主动脉的舒张作用与机制[J]. 哈尔滨医科大学学报,2010,44(4):315

[6] 韩亚蓉.银杏叶提取物及其主要成分白果内酯对不同年龄大鼠胸主动脉环的舒张作用[J]. 实用医学杂志,2009,25(17):2829

[7] 周新妹,姚慧,夏满莉，等.槲皮素与芦丁对离体大鼠主动脉环的舒张作用及机制[J]. 浙江大学学报：医学版,2006,35(1):29

[8] Wang BH,Ou-Yang JP. Pharmacological actions of sodium ferulate in cardiovascular system[J]. Cardiovasc Drug Rev,2005,23(2):161

[9] Srinivasan M,Sudheer AR,Menon VP. Ferulic acid:therapeutic potential through its antioxidant property[J]. J Clin Biochem Nutr,2007,40(2):92

[10]张帆,游陆, 张东献.阿魏酸钠对ox-LDL诱导血管内皮细胞凋亡的影响[J]. 解放军医学杂志,2012,37(6):581

[11]Chen GP, Ye Y, Li L, et al. Endothelium-independent vasorelaxant effect of sodium ferulate on rat thoracic aorta[J]. Life Sci,2009,84(3/4):81

[12]Gojkovic-Bukarica L, Novakovic A, Kanjuh V, et al. A role of ion channels in the endothelium-independent relaxation of rat mesenteric artery induced by resveratrol[J]. J Pharmacol Sci,2008,108(1):124

[13]杨宝峰.离子通道药理学[M].北京:人民卫生出版社, 2005:155