赵富周

南阳医学高等专科学校第一附属医院胸外科 南阳 473000

食管癌是消化道常见恶性肿瘤之一。大多数患者就诊时已有区域及(或)远处淋巴结转移，而淋巴转移为食管癌复发转移的主要途径之一，可明显影响患者的预后和生存[1-2]。淋巴转移的机制已经成为近年来肿瘤领域研究的热点问题[3]。趋化因子受体-7(chemokine receptor-7，CCR7)在某些肿瘤组织中有较高的表达[4]，其与相应的配体结合能够使肿瘤血管、淋巴管形成，使表达CCR7的肿瘤细胞发生增殖、肌动蛋白凝集和伪足形成，并使肿瘤细胞沿配体浓度梯度定向转移。肾小球上皮整合膜蛋白(Podoplanin)是一种位于肾小球足突细胞膜表面的蛋白。Podoplanin标记淋巴管内皮细胞的特异性和敏感性均较高，是当前比较理想的一种淋巴管内皮细胞标志物[5]。该研究通过免疫组化的方法研究40例食管癌组织中CCR7、Podoplanin的表达，旨在探讨食管癌淋巴转移的可能机制。

1 材料与方法

1.1材料40例食管癌组织标本来自南阳医学高等专科学校第一附属医院2011年2月至2012年2月手术切除组织，均经两位高年资病理医师证实为鳞状细胞癌(食管鳞癌)。其中男25例，女15例。年龄44～79岁，中位年龄60.1岁。按照1976年全国食管癌临床病理分期标准：Ⅰ、Ⅱ期12例，Ⅲ、Ⅳ期28例；高、中分化21例；低、未分化19例。有淋巴结转移28例，无淋巴结转移12例。每例标本均同时取癌组织、癌旁正常食管组织，其中癌旁正常组织要求距肿瘤边缘5 cm以上，并经病理证实无肿瘤累及、无跳跃转移病灶。所有病例术前均未行化放疗或其他针对肿瘤的治疗。

1.2CCR7和Podoplanin蛋白表达的检测采用免疫组化SP法。鼠抗人CCR7单克隆抗体(按1300稀释)和鼠抗人Podoplanin单克隆抗体(按1200稀释)均购自武汉博士德生物工程有限公司，SP免疫组化试剂盒和DAB试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。切片常规脱蜡，微波抗原修复，操作按试剂盒说明进行。用已知的食管癌阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。

1.3结果判定①CCR7结果判定：以细胞膜和(或)细胞质中出现黄色/棕黄色颗粒为阳性细胞。先按整张切片中阳性细胞百分比评分,阳性细胞百分比为0%、1%～、25%～、50%～、75%～100%分别计为0、1、2、3、4分。再按整张切片中细胞染色深度评分：无色、浅黄色、棕褐色分别计为0、1、2分。2项评分相乘，积分<4分判为阴性，≥4分判为阳性[6]。②依据Ohno等[7]和Weidner[8]的方法，判定Podoplanin标记淋巴管内皮细胞计数的微淋巴管密度(MLVD)值：先在低倍镜视野下选取肿瘤中心脉管最丰富的区域，再在200倍视野下计数Podoplanin阳性脉管数，每例计数5个视野，并求其均值作为MLVD。两名医师计数差10%以上者重新计数。为较准确判定淋巴管，对内皮细胞着色者判定为微淋巴管，基膜与内皮细胞均着色者则判定为微血管，对于光镜下较难区分的管道也暂判为微血管。

1.4统计学处理采用SPSS 10.0进行分析，应用配对χ2检验比较2种组织中CCR7蛋白的表达；配对资料的秩和检验分析2种组织中Podoplanin蛋白的表达；应用t检验比较食管鳞癌组织中CCR7蛋白表达阳性组与阴性组间Podoplanin蛋白的表达；分别用校正χ2检验和t检验分析食管鳞癌组织中CCR7蛋白、MLVD值与临床病理特征的关系，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1食管鳞癌和癌旁正常食管组织中CCR7蛋白的表达及分布特点见图1和表1。食管鳞癌组织中CCR7蛋白阳性表达率为72.5%(29/40)。肿瘤组织浸润边缘和坏死明显的区域内呈强阳性着色；肿瘤中心部位阳性表达也较强，但与肿瘤边缘相比相对较弱；而在癌旁正常组织中CCR7蛋白阳性表达率仅为5.0%(2/40)。

图1 食管鳞癌(A)和癌旁正常食管(B)组织中CCR7蛋白的表达(SP，×100)

表1 食管鳞癌和癌旁正常食管组织中CCR7蛋白的表达 例

校正χ2=23.310,P<0.001。

2.2食管鳞癌和癌旁正常食管组织中Podoplanin蛋白的表达及分布特点见图2。食管鳞癌组织中Podoplanin蛋白的分布具有异质性，主要在癌巢周围分布；癌旁正常食管组织黏膜下仅见少量表达。食管鳞癌组织中Podoplanin标记的MLVD值为(7.2±3.2)，高于癌旁正常食管组织(1.5±0.5)，Z=5.416，P<0.001。

2.3食管鳞癌组织中CCR7蛋白表达与Podoplanin标记的MLVD值的关系CCR7蛋白表达阳性的食管鳞癌组织中Podoplanin标记的MLVD值为(8.4±5.0)，CCR7蛋白表达阴性组织中MLVD值为(2.9±2.1)，差异有统计学意义(t=3.478，P<0.001)。

图2 食管鳞癌(A)和癌旁正常食管(B)组织中Podoplanin蛋白的表达(SP，×200)

2.4食管鳞癌组织中CCR7蛋白表达、MLVD值与临床病理特征的关系见表2。

表2 食管鳞癌组织中CCR7蛋白表达、MLVD值与临床病理特征的关系

*：校正χ2检验。

3 讨论

近些年来，趋化因子及其受体的研究成为肿瘤淋巴转移方面的热点。CCR7是趋化因子CC类的受体成员之一，其配体有CCL21、CCL19，主要在淋巴结、非淋巴组织的内皮淋巴导管、T细胞区表达。趋化因子CCL19/CCL21与受体CCR7相互作用，可吸引并促进CCR7蛋白阳性表达的肿瘤细胞发生伪足形成和肌动蛋白凝集，并使其沿其配体CCL19/CCL21浓度梯度定向迁移，这可能是肿瘤细胞发生淋巴转移的机制之一[9]。研究[10]表明CCR7在许多恶性肿瘤组织中有较高表达，并对这些肿瘤细胞的趋化和淋巴结归巢起重要作用。

Tsutsui等[11]的研究表明，肿瘤淋巴结转移与淋巴管生成密切相关，新生淋巴管达到一定数量后即为肿瘤的淋巴转移创造了条件。因此，有针对性地标记新生淋巴管，了解肿瘤组织淋巴管分布情况，成为研究肿瘤淋巴转移的关键。Breteneder-Geleff等[12]首次提出利用Podoplanin染色法判定淋巴管，为肿瘤淋巴管生成研究提供了较为可靠的手段。

该研究采用免疫组化法检测了食管鳞癌组织、癌旁正常食管组织中CCR7蛋白的表达，并计数了以Podoplanin标记淋巴管内皮细胞的MLVD值，同时分析了它们与临床病理特征的关系。结果表明：食管鳞癌组织中CCR7的表达及MLVD值较癌旁正常食管组织明显增高，且食管鳞癌组织中CCR7蛋白的表达及MLVD值与肿瘤病理分期和淋巴结转移关系密切，而与性别、年龄、肿瘤直径及分化程度无关。提示CCR7、Podoplanin蛋白表达水平的上调是食管鳞癌发生淋巴转移过程中的重要事件。这与Ishida等[13]和张潍等[5]的研究一致。该研究还对食管鳞癌组织中CCR7蛋白阳性表达组和阴性表达组MLVD值进行了比较，结果发现阳性表达组MLVD值明显高于阴性表达组，这在目前文献中未见报道, 提示在肿瘤组织中CCR7蛋白的表达与肿瘤组织中形成的MLVD值是一致的，高密度的淋巴管形成为肿瘤的转移提供了物质条件，这也更进一步揭示了CCR7蛋白阳性表达的肿瘤更容易发生淋巴转移的可能原因。CCR7、MLVD值可以作为反映食管鳞癌恶性生物学行为的指标。

总之，CCR7、Podoplanin蛋白在食管鳞癌组织中均高表达，CCR7、Podoplanin在反映食管鳞癌的生长、侵袭及其淋巴转移方面具有一致性。提示联合检测CCR7、Podoplanin有可能用于预测食管鳞癌淋巴转移，这对食管鳞癌治疗方案的选择和确定有积极的指导意义。

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