李鹏，申铉日，陶摸，陈婷

(海南大学 食品学院，海南海口，570228)

抗坏血酸(L-ascorbic acid，AA)，俗称 VC，在食品中被广泛的作为维生素补充剂和抗氧化剂，对人体代谢过程和生命活动的许多方面也具有重要影响;在医药上具有预防出血、解毒、增强机体对疾病的抵抗力、降低癌症的发生率等作用［1］;还可抑制酪氨酸酶的活性，从而阻止黑色素生产［2］，并能降低紫外线对细胞的损害，故抗坏血酸对美白肤色、保持皮肤弹性及防止皱纹的产生有一定的效用［3］。但常用的抗坏血酸产品在空气和水中极不稳定，不溶于油相，使其应用受到了一定的限制。所以获得稳定有效的抗坏血酸体系一直受到广泛的关注［4］。微胶囊技术因可以在活性物质表面形成保护层，达到保护、缓释活性物质的目的，而受到众多学者的关注。通过抗坏血酸微胶囊保护和缓释抗坏血酸的研究已有报道［5－6］，在制药方面的应用的时间已经很长，但在食品方向的发展最近才兴起［7］，且包埋率多不理想，喷雾干燥法获得的抗坏血酸微胶囊包埋率低于50%［8］，使用糖玻璃化技术制得的抗坏血酸微胶囊也仅为70%［9］，一些包埋率稍高的微胶囊多为复合壁材，使用单一壁材获得较高包埋率的微胶囊尚未见报道。选择良好的微胶囊方法，配合合适的微胶囊壁材，将有望改善抗坏血酸微胶囊的包埋率。明胶以其优异的理化性能、良好的生物相容性，成为不可多得的微胶囊制备材料。罗非鱼鱼鳞提取的明胶的开发利用［10］由于充分利用了废弃物，提高了罗非鱼产品的附加值而倍受关注。鱼类明胶与哺乳动物源明胶的性质存在差异［11－12］，但该差异对于明胶作为微胶囊壁材而使用的利弊尚无定论。本实验以罗非鱼鱼鳞提取的明胶为壁材，通过Tanaka［13］提出的与其他物理化学方法相比所需设备简易、条件温和的乳化法制备微胶囊。并将该方法与超声波技术相结合，以克服微胶囊粒径偏大、分布范围宽的现象。在此基础上以谷氨酰胺转胺酶(TG酶)代替通常使用的具有一定毒性的戊二醛［14］作为交联剂，以食品用乳化剂山梨醇酐三硬脂酸酯为乳化剂在超声波作用下制备食用性强的抗坏血酸微胶囊，以期说明该来源明胶在替代哺乳动物来源明胶作为微胶囊壁材的可行性，拓展该鱼鳞明胶的应用范围。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗非鱼鱼鳞，海南泉溢食品有限公司提供;植物甾醇玉米油，金龙鱼有限公司;谷氨酰胺转氨酶(TG酶)，南宁庞博生物工程有限公司;食品级山梨醇酐三硬脂酸酯，广州食品添加剂有限公司;L-抗坏血酸，广州化学试剂厂;无水乙醇(AR级);明胶，天津市福晨化学试剂厂;其他试剂均为分析纯。

超声波清洗机XO-5200DTD，南京先歇仪器有限公司;7200型分光光度计，尤尼柯上海仪器有限公司;恒温磁力搅拌器，常州奥华仪器有限公司;Olympus生物显微镜，奥林巴斯BX41TF，日本，Olympus公司;水浴锅H-10002511，上海精宏实验设备有限公司，Winner型激光粒度分析仪，济南维纳颗粒技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 罗非鱼鱼鳞明胶的制备

取干罗非鱼鱼鳞300 g清洗后用体积分数为30%的HCl 1 500 mL浸泡搅拌15 min脱灰，然后用蒸馏水反复清洗至中性，再将沥干的鱼鳞放入浓度为4 g/L的NaOH溶液中搅拌12 h，除去脂肪和杂蛋白，将清洗后的鱼鳞放入1 600 mL蒸馏水中用95℃水浴提取3h，布氏漏斗过滤，滤液经冷冻干燥后即获得水溶性鱼鳞明胶。

1.2.2 微胶囊的制备

微胶囊的制备流程如图1所示。用蒸馏水将罗非鱼鱼鳞明胶配制成一定浓度溶液并与一定浓度的抗坏血酸溶液混合得到A液，然后将A液用注射器加入到含有一定量乳化剂的玉米油混合液B中。用超声波处理该AB混合液10 min后，用质量分数10%NaOH将其pH值调为6.0［15］，在磁力搅拌器的作用下加入1mL谷氨酰胺转氨酶，搅拌1min后，再加入30mL体积分数50%乙醇，同样磁力搅拌1min后将样品至于一定温度的水浴锅中，待溶液分层后，去除上层油层，再用10%NaOH将样品pH值调为10，维持该pH值灭酶10 min，然后用10%醋酸将pH值调回7即得到微胶囊乳液。

图1 罗非鱼鱼鳞明胶微胶囊包埋抗坏血酸的制备流程Fig.1 The preparation process of Tilapia scale gelatin microcapsules embedded ascorbic acid

1.2.3 抗坏血酸的测定

精密称取一定量的抗坏血酸标准样品，配制成0.25 mg/mL 的标准溶液，分别取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL 该样液，并分别加入 1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.2、0 mL 的蒸馏水，再向上述总体积为1 mL的溶液中分别加入2.0 mL草酸-EDTA、0.5 mL 偏磷酸-乙酸、1.0mL 硫酸、2.0 mL 5%钼酸铵溶液，摇匀后，静置5 min，以蒸馏水为空白在760 nm的波长处测定吸光度。以吸光度(A)对质量(m)进行线性回归，得到标准曲线回归方程为A=0.002 5m+0.000 5(R2=0.999)，见图 2。

图2 抗坏血酸标准曲线Fig.2 The standard curve of Ascorbic acid

1.2.4 未包埋抗坏血酸含量的测定

取1 mL微胶囊化溶液，置于截留分子质量为8 000～14 000 Da的透析膜中，透析膜置于含有20 mL蒸馏水的50 mL用锡箔纸包裹的避免外界光线照射的离心管中，离心管于5℃冰箱中放置24 h之后，取透析外液以蒸馏水为空白在760 nm处测定吸光度，根据抗坏血酸标准曲线计算出未包埋抗坏血酸含量。

1.2.5 微胶囊的评价

1.2.5.1 微胶囊对抗坏血酸的包埋率

由于不易直接测定明胶对抗坏血酸的包埋率，故采用间接测定的方法。

包埋率/%=(加入抗坏血酸总质量－透析外液抗坏血酸质量)/加入抗坏血酸总质量

本实验中的计算公式为:

其中:mAA为实验过程中加入的抗坏血酸的总质量;A760为透析液的吸光值;W1为微胶囊包埋率。

1.2.5.2 玉米油分层的测定

将制备的样品置于相同的容器中，测定油相析出量随时间的变化确定固化时间对油相析出的影响，确定最佳静置时间，确保在最短时间内获得最佳效果。以样品所能析出的玉米油的最大体积为分母，不同时间段所测得的析出玉米油体积为分子，该数值的百分数作为评价指标，最短时间内，该指标值越大，则分层效果越好，越有利于微胶囊的高效制备。

1.2.5.3 微胶囊形貌的测定

通过显微镜观察微胶囊的形状;并通过本实验采用Winner型激光粒度分析仪测定所制备微胶囊。选取了平均粒径以及比表面积对微胶囊进行了评价。

2 结果与讨论

2.1 乳化剂对包埋率的影响

按照图1所示制备微胶囊，各参数值为:罗非鱼鱼鳞明胶30 mg/mL为壁材，15 mg/mL为芯材，按体积比1∶1混合后得到质量比为2∶1的明胶和抗坏血酸得混合液A，含有一定量乳化剂(食品级山梨醇酐三硬脂酸酯)的20 mL玉米油为混合液B，固化剂谷氨酰胺转氨酶(TG酶)(0.12 g/mL)的添加量为1 mL，40℃水浴的固化时间为4 h。在此制备条件下对乳化剂用量对包埋率的影响进行了探讨。所取乳化剂用量为 20，40，60，80，100，120 μL。结果如图 3 所示，随着乳化剂含量的升高，微胶囊的包埋率随着加入乳化剂体积的增加先增加后降低，呈现抛物线趋势，且当乳化剂用量为100 μL时，所得的微胶囊包埋率最高为79.46%。

图3 乳化剂添加量对罗非鱼鱼鳞明胶微胶囊对抗坏血酸包埋率的影响Fig.3 Emulsifier affect tilapia fish scale gelatin microcapsule embedding rate of ascorbic acid

2.2 微胶囊固化时间对连续相分层的影响

在制备微胶囊的过程中，添加TG酶和乙醇后于40℃水浴锅中静置，有利于TG酶对鱼鳞明胶的交联［15］，从而获得更加稳定的微胶囊即完成微胶囊的固化过程。该过程是谷氨酰胺转氨酶(蛋白质-谷氨酸氨基-γ-谷胺酰转移酶，EC2.3.2.13)通过酰基转移机理催化蛋白质交联反应，涉及到蛋白结合的谷氨酰氨(酰胺供体)基和伯胺(酰胺受体)，包括某些蛋白质中的赖氨酸残基中ε-氨基。由谷氨酰胺转氨酶催化的蛋白质共价交联能够引起蛋白质排列、构象、稳定性的变化。此过程中，玉米油随着时间的推移逐渐析出，将析出的玉米油去除即得到单一的明胶包埋抗坏血酸的微胶囊。在微胶囊制备的整个流程中，耗时最长的步骤为40℃的水浴固化，为了在较合适的时间内获得玉米油的最佳分离效果，本实验对玉米油析出体积与时间变化进行了测定。结果显示(图4)，随着固化时间的增加，连续相分层逐渐明显。当固化时间达到7 h时已可以将流动相很好地分离了。以8 h析出的连续相量为分母，按照析出玉米油的评价方法，第7小时所析出的连续相已经达到97.99%，此时已经可以很好的将流动相去除。故以7h作为制备该微胶囊所需的固化时间。

图4 微胶囊固化时间对罗非鱼鱼鳞明胶微胶囊对抗坏血酸包埋率的影响Fig.4 The separating time of mobile phase affect tilapia fish scale gelatin microcapsule embedding rate of ascorbic acid

2.3 连续相玉米油用量对包埋率的影响

玉米油在鱼鳞明胶形成微胶囊的过程中，在乳化剂的作用下形成均一体系，有助于微胶囊的形成，该过程可能影响微胶囊的包埋率。而且，在乳化剂含量一定的情况下，乳液的乳化能力应该是一定的，则所能够利用的玉米油体积也可能是有限的，因此，此条件下应该存在玉米油的最适用量，以获得较高的微胶囊包埋率。为了获得这个最佳值，本文在前面探头的基础上即在乳化剂山梨醇酐三硬脂酸酯为100 μL，固化时间为7h的条件下，按照图1制备微胶囊的流程制备微胶囊，对玉米油的用量为 5、10、15、20、30 mL进行了探讨。结果如图5所示。玉米油用量对所形成微胶囊的包埋率确实存在影响，且当玉米油用量小于20 mL时，包埋率随着玉米油用量的增加而增加，当玉米油用量为20 mL时，鱼鳞明胶微胶囊对VC的包埋率达到最高，为89.73%。此后玉米油再增加，包埋率反而减小。与推测相符合，故在此条件下，玉米油作为流动相的最佳用量为20 mL。

2.4 明胶与抗坏血酸比例对包埋率的影响

罗非鱼鱼鳞明胶作壁材包埋抗坏血酸时，在一定情况下形成的微粒子数量是有限的，因此在制备的过程中，还应该探讨一定量明胶所能包埋抗坏血酸的最佳值。故对抗坏血酸用量与微胶囊包埋率进行了探讨。在乳化剂用量为100 μL，固化时间为7 h，玉米油用量为20 mL的情况下分别探讨了抗坏血酸质量为明胶质量的0.25、0.5、1、2、3倍时，所形成微微胶囊的包埋率。结果如图6所示。当抗坏血酸质量为明胶质量的0.5倍即两者质量比为1∶2时，所得到微粒子的包埋率最大，为89.73%。大于或小于该比例均会导致包埋率下降。故选择鱼鳞明胶与抗坏血酸的质量比为2∶1。至此，获得制备微胶囊的最佳条件。

图5 玉米油用量对罗非鱼鱼鳞明胶微胶囊对抗坏血酸包埋率的影响Fig.5 Mobile phase of corn oil affect tilapia fish scale gelatin microcapsule embedding rate of ascorbic acid

图6 对罗非鱼鱼鳞明胶微胶囊对抗坏血酸包埋率的影响Fig.6 The mass ratio of ascorbic acid and gelatin affect tilapia fish scale gelatin microcapsule embedding rate of ascorbic acid

2.5 动物明胶与罗非鱼鱼鳞明胶对于微胶囊包埋率的影响

分别取相同量的动物明胶和罗非鱼鱼鳞明胶，在前面探讨获得的最高包埋率的微胶囊制备条件下，分别制备微胶囊，并比较所得2种微胶囊的包埋率。动物明胶所得抗坏血酸微胶囊包埋率为57.3%，该值低于鱼鳞明胶所制备的微胶囊的包埋率89.73%。故鱼鳞明胶比较适合该方法，并可以通过该方法获得包埋率相对较高的抗坏血酸微胶囊。

2.6 罗非鱼鱼鳞明胶包埋抗坏血酸微胶囊的形状及粒径分布

通过显微镜观察包埋率最高为89.73%的微胶囊溶液中微胶囊的形貌。如图7所示，在(100×100)μm的视野内含有大量微胶囊，且所得微胶囊为球形。

图7 罗非鱼鱼鳞明胶包埋抗坏血酸微胶囊形貌Fig.7 The morphology of tilapia scale gelatin microcapsules embedding ascorbic acid

通过激光粒度分析仪测定了所制备微胶囊的粒径分布(结果如图8所示)。所制备微粒子平均粒径为3.57 μm，粒径分布现对较为集中，比表面积为18 139.16 cm2/cm3。

图8 罗非鱼鱼鳞明胶包埋抗坏血酸微胶囊的粒径分布Fig.8 The particle size distribution of the tilapia scale gelatin microcapsules embedding ascorbic acid

3 结论

使用海南盛产的罗非鱼加工下脚料鱼鳞提取的明胶作为壁材，20 mL的玉米油为流动相，100 μL食品级山梨醇酐三硬脂酸酯为乳化剂，无毒副作用的TG酶为架桥剂，在40℃下固化7 h，15 mg/mL罗非鱼鱼鳞明胶与抗坏血酸质量比为2∶1，制备包埋抗坏血酸的微胶囊为球形，在显微镜下观察不出现凝聚现象，所制备微粒子平均粒径为3.57 μm，粒径分布现对较为集中。且以罗非鱼鱼鳞明胶为壁材可获得较哺乳动物源明胶制备包埋抗坏血酸更高的包埋率，这说明鱼鳞明胶在微胶囊中以壁材的形式得到应用具有一定的可行性，并具有代替哺乳动物源明胶的潜力。

［1］ Englard S，Seifter S.The biochemical functions of ascorbic acid［J］.Annual Review of Nutrition，1986(6):365 －406.

［2］ 裘炳毅.化妆品化学与工业技术大全［M］.北京:中国轻工业出版社，2000:630.

［3］ 李诚让，朱文元.维生素C衍生物研究进展［J］.临床皮肤科杂志，2005，34(7):487 －488.

［4］ 张海州，邹佳丽，戴静亚，等.用于稳定化妆品中维生素C的油包多元醇体系的研究［J］.日用品化学工业，2009，39(4):249－252.

［5］ Lee J B，Ahn J，Lee J，et al.L-ascorbic acid microencapsulated with polyacylglycerol monostearate for milk fortification［J］.Bioscience Biotechnology Biochemistry，2004，68(3):495－500.

［6］ Uddin M S，Hawlader M N A，Zhu H J.Microencapsulation of ascorbic acid:effect of process variables on product characteristics［J］.Journal of Microencapsulation，2001，18(2):199－209.

［7］ Heloiza Vieira Rodrigues Pereira，Karina Peixoto Saraiva，Lucia Maria Jaeger Carvalho，et al.Legumes seeds protein isolates in the protein isolates in the production of ascorbic acid microparticles［J］.Anna Paola Trindade Rocha Pierucci，2009，42:115 －121.

［8］ Desai K G，Park H J.Effect of manufacturing parameters on the characteristics of vitamin C encapsulated tripolyphosphatechitosan microspheres prepared by spray-drying［J］.Journal of Microencapsulation，2006，23(1):91－103.

［9］ 孟宪娇，任国谱.VC的微胶囊化研究［J］.食品与机械，2009(3):135－138.

［10］ Falguni Pati，Basudam Adhikari，Santanu Dhara.Isolation and characterization of fish scale collagen of higher thermal stability［J］.Bioresource Technology，2010，10(101):3737－3742.

［11］ Gómez-Gullén M C，Giménez B，López-Caballero M E，et al.Functional and bioactive properties of collagen and gelatin from alternative sources:A review［J］.Food Hydrocolloids，2011，8(25):1 813－1 827.

［12］ Badii F，Howell N K.Fish gelatin:structure，gelling properties and interaction with egg albumen proteins［J］.Food Hydrocolloids，2006，5(20):630－640.

［13］ Tanaka N，Takino S，Utsumi I.A new oral gelatinized sustained-release dosage form［J］.Journal of Pharmaceutical Sciences，1963，52(7):664 －667.

［14］ Usha R，Ramasami T.Sturchure and conformation of intra-molecularly crosslinked collagen［J］.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces，2005，41(1):21－22.

［15］ Geun Pyo Hong，Sang-Gi Min，Koo Bok Chin.Emulsion properties of pork myofibrillar protein in combination with microbial transglutaminaes and calcium alginate under various pH conditions［J］.Meat Science，2010，90(1):185－193.