薛 梅，李彦希，史丙俊，王祖红，江 阳，唐海燕

（重庆市中医院皮肤科，重庆 400011）

炎症后色素沉着是激光治疗的常见并发症，其发病率的不可预测、病程的不一致、预后的不确切等因素，非常困扰医师和患者。如何有效预防炎症后色素沉着的发生，已经成为临床工作中非常需要解决的问题。

本实验用Q开关Nd：YAG激光处理豚鼠背部皮肤，之后用参苓白术散加减颗粒对其干预，探讨参苓白术散加减颗粒对激光术后色素沉着的影响。

1 材料和方法

1.1 动物

动物为成年健康豚鼠，一级英国短尾豚鼠，批号[川实动管质第17号]，共50只，体重250～280g，由泸州医学院实验动物中心提供，饲养条件一级。

1.2 中药

参苓白术散加减颗粒由泸州医学院附属医院制剂科制备，呈淡褐色颗粒状，共由黄芪、党参、白术、茯苓、山药、莲子、枸杞子、当归、桔梗等九味中药组成。每袋参苓白术散加减颗粒10克，相当于生药19.2克。

1.3 试剂

SOD测定试剂盒、CAT测定试剂盒、MDA测定试剂盒，均购自南京建成生物研究所。SV总RNA提取试剂盒（Promega），Access RT-PCR试剂盒（Promega），pGEM DNA标准参照物（Promega），焦碳酸二乙酯（DEPC）（Fluka）。特异引物由中国科学院上海细胞所合成，引物序列如下：鼠酪氨酸酶：5’-TTCAAAGGGGTGGATGACCG-3’.5’-GACACATAGTAATGCATCC-3 ‘（319 bp）；鼠β-肌动蛋白：5’-TCAGAAGGACTCCTATG- TCG-3’，5’-TCTCTTTGATG TCACGCACG-3’（500 bp）。Perkin-Elmer Cetus热循环仪（美国Perkin-Elmer公司），White/Ultroviolet Transilluminator凝胶扫描仪（美国Gene公司）。其余有关试剂及材料均为进口或国产分析纯产品。

1.4 方法

取健康成年豚鼠50只，体重250～280g，雌雄不拘以重量随机分为参苓白术散加减颗粒高剂量组、低剂量组、维生素（E+C组）、生理盐水组和激光对照组共五组，每组各10只。

1.4.1 对豚鼠进行激光处理 选取每只豚鼠背部脊柱两侧四处每块约2×2cm范围，分别用Q开关Nd：YAG激光进行照射，参数设置为：波长：1064nm，能量密度：1.5J/cm2，脉冲宽度：10ns，光斑直径：3mm。

1.4.2 取材 激光照射前和照射后即刻，分别对实验组激光照射区域与对照豚鼠背部相应部位取皮肤组织活检，用手术刀切取长约1.5cm，宽约1cm，厚约0.3cm大小的组织块，将取下的组织块以10%甲醛液固定，石蜡包埋，做成石蜡块备用。同时经每只豚鼠心脏抽血5ml，注入到预冷的加有促凝剂的试管中混匀，分离血清后，置于低温冰箱保存待检。

1.4.3 药物治疗 激光照射并取皮肤活检后，按上诉治疗前的分组，对豚鼠进行参苓白术散加减颗粒低剂量、高剂量、维生素E+C、生理盐水灌胃，剂量分别为0.3g/kg，2g/kg，30mg/kg，4ml/kg。每天两次，连续四周。在灌胃后第四周于激光照射区域边缘如前法切取豚鼠皮肤组织进行活体检查，组织块仍以10%甲醛液固定，石蜡包埋做成石蜡块备用；同时如前法抽取豚鼠心脏血5ml，分离血清后置于低温冰箱保存待检。

1.4.4 HE染色 将制成的石蜡组织块切片（5μm）、表片、吹片（约30分钟），脱蜡，用苏木素、伊红染色，脱水，透明，封片，光镜下观察。

将制成的石蜡组织块切片（5μm）、表片、吹片（约30分钟），进行脱蜡，水洗，将切片置于新鲜配置的0.037mol/l（1%）的氯化铁35ml，新鲜配置的0.03mol/l（1%）的铁氰化钾4ml，蒸馏水6ml组成的混合液中放置10分钟，将切片放入1%藏花红液体中30秒钟，水洗，常规脱水、透明、封片。光镜下观察。

1.4.5 检测SOD、CAT、MDA 用黄嘌呤氧化酶法检测SOD、用可见光法检测CAT，用硫代巴比妥酸即TBA法检测MDA。

1.4.6 局部皮肤所含黑素颗粒结果判断 每张切片随机选取5个互不重叠的视野，找到阳性目标（皮肤表皮和附件上皮细胞胞浆中呈现棕黄色、黑色颗粒）后，用CMIAS系列98A型图像分析系统对目标图像进行等量分析，得出每张切片5个视野黑黑素颗粒的平均面积、目标与统计场面积之比（面密度）。

1.4.7 RT-PCR检测 1）总RNA提取：应用sv总RNA提取试剂盒，按照试剂盒说明提取总RNA。2）RT-PCR：应用Access RT-PCR试剂盒，建立RT-PCR反应体系50µl，无核酶水20µl，AMV/Tfl 5×反应液10µl，0.2mmol/L dNTP混合液（10mmol/L每种dNTP1µl），1pmol/L特异性上游引物（10pmpl/µl）5µl，和1pmol/L特异性下游引物（10pmol/µl），25mmol/L MgSO4，2µl（终浓度1mmol/L），AMV逆转录酶（5U/µl）1µl，Tfl DNA聚合酶（5U/µl）1µl，RNA模板5µl。反应程序：48℃45min 1个循环，94℃ 30s、60℃ 1min、68℃ 2min，40个循环，68℃ 7min，1个循环。4℃储存备用。3）PCR产物分析：取PCR扩增产物10µl在含0.5ml溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳，电泳完毕后再凝胶扫描仪上观察结果。拍照记录并用Lab works 3.0软件对扩增产物进行光密度分析。酪氨酸酶基因表达水平以光密度指数（ODI）表示即酪氨酸酶mRNA A值/β-肌动蛋白mRNA A值。

1.4.8 统计学方法 实验数据采用SPSS11.0统计软件包进行分析，检测结果以均数±标准差（）表示，统计方法采用单因素方差分析和t检验分析，组间均值两两比较用SNK法，检验水平а=0.05。

2 结果

2.1 豚鼠背部皮肤的肉眼、组织学观察

2.1.1 肉眼观察 剃除豚鼠背部毛发，激光处理后即刻可见处理部位变白，激光处理后一周可见灰色薄痂；生理盐水组激光处理一月后照射部位边缘出现较多黑素斑点，维生素组也在相同部位出现少量黑素斑点，中药低剂量及高剂量组激光照射部位仍为白色，未发现明显的黑素斑点。

2.1.2 组织学观察 在光镜下正常豚鼠皮肤显示表皮、真皮结构正常，可见表皮基底层和毛囊处较多黑素颗粒；激光处理后即刻见表皮角质层脱落，未见黑素颗粒；激光处理后一月中药高剂量组未见明显黑素颗粒，毛囊处未见黑素颗粒；低剂量组见少量黑素颗粒，毛囊处未见黑素颗粒；维生素组见少量黑素颗粒，毛囊处未见黑素颗粒；生理盐水组和激光对照组基底层出现大量黑素颗粒，毛囊处未见黑素颗粒。

2.2 S chmorl染色

光镜下可见黑素颗粒被染成棕黄色、黑色颗粒。豚鼠黑色皮肤可见较多黑素颗粒，激光处理后即刻未见黑素颗粒，生理盐水组一月时切片可见基底层和棘细胞层有大量黑素颗粒，黑素颗粒量多密集，着色很深，且多呈黑色。中药低剂量组和维生素组一月时切片也可见基底层和棘细胞层黑素颗粒增加。中药高剂量组治疗一月后仅在基底层见到少量的黑素颗粒。

2.3 数据统计分析结果

2.3.1 治疗一月后药物对皮肤黑素颗粒的影响 治疗一月后，中药高剂量组豚鼠有两只死于意外，维生素组有一只死于意外，其余豚鼠均进行活体取材，经Schmorl染色制成病理切片在高倍镜（×40）下每张切片随机选取5个互不重叠的视野，找到阳性目标（皮肤表皮和附件上皮细胞胞浆中呈现棕黄色、黑色颗粒）后，用CMIAS系列98A型图像分析系统对目标图像进行定量分析，得出每张切片5个视野黑素颗粒的平均面积、目标与统计场面积之比（面密度）。见表1、表2。

表1 药物治疗一月后豚鼠皮肤中黑素颗粒面积（）

表1 药物治疗一月后豚鼠皮肤中黑素颗粒面积（）

组别 N 目标面积（um2）生理盐水组 50 6564.9±2231.9●维生素组 45 3259.8±1433.7△▲中药高剂量组 40 506.5±395.6★中药低剂量组 50 1220.2±659.5△▲激光对照组 50 10646.9±2008.4

单因素方差分析：F=795.438，X2组间=133518.207，X2组内=167.855，P=0.000。SNK：▲与激光对照组相比，P=0.000；△与生理盐水组比较，P=0.000；●与中药颗粒高剂量组比较，P=0.000；★与维生素组之间比较，P=0.000。

表2 药物治疗一月后豚鼠皮肤中黑素颗粒面密度（）

表2 药物治疗一月后豚鼠皮肤中黑素颗粒面密度（）

组别 N 面密度生理盐水组 50 0.015±0.005●维生素组 45 0.007±0.003△▲中药高剂量组 40 0.001±0.000★中药低剂量组 50 0.003±0.001△▲激光对照组 50 0.025±0.005

单因素方差分析：F=26.069，X2组间=0.587，X2组内=0.023，P=0.000。SNK：▲与激光对照组相比，P=0.000；△与生理盐水组比较，P=0.000；●与中药高剂量组比较，P=0.000；★与维生素E+C组之间比较，P＜0.05。

2.3.2 血清中SOD的检测结果（见表3）。

表3 治疗30天后各组豚鼠血清中SOD的水平比较（）

表3 治疗30天后各组豚鼠血清中SOD的水平比较（）

组别 N SOD（U/ml）生理盐水组 50 121.14±29.02●维生素组 45 146.16±15.67△▲中药高剂量组 40 164.71±7.69★中药低剂量组 50 147.21±16.87△▲激光对照组 50 118.97±28.28

单因素方差分析，F=18.455，X2组间=9211.753，X2组内=499.148，P=0.000.SNK：▲与激光对照组相比，P=0.000；△与生理盐水组比较，P=0.001；●与中药高剂量组比较，P=0.000；★与维生素组之间比较，P=0.014。

2.3.3 血清中CAT的检测结果（见表4）。

表4 治疗30天后各组豚鼠血清中CAT的水平比较（）

表4 治疗30天后各组豚鼠血清中CAT的水平比较（）

组别 N CAT（U/ml）生理盐水组 50 5.35±2.42●维生素E+C组 45 12.68±6.22△▲中药高剂量组 40 17.06±3.40★▲中药低剂量组 50 11.39±5.24△▲激光对照组 50 5.19±2.27

单因素方差分析，F=42.588，X2组间=642.548，X2组内=15.098，P=0.000。SNK：▲与激光对照组相比，P=0.000；●与中药高剂量组比较，P=0.000；△与生理盐水组比较，P=0.000；★与维生素组比较，P=0.001。

2.3.4 血清中MDA的检测结果（见表5）。

表5 治疗30天后各组豚鼠血清中MDA的水平比较（）

表5 治疗30天后各组豚鼠血清中MDA的水平比较（）

组别 N MDA（nmol/ml）生理盐水组 50 10.85±0.56●维生素E+C组 45 10.61±0.47▲中药高剂量组 40 10.20±0.33★☆中药低剂量组 50 10.54±0.49▲激光对照组 50 11.05±0.57

单因素方差分析，F=10.802，X2组间=2.535，X2组内=0.535，P=0.000。SNK：▲与激光对照组相比，P=0.005；☆与激光对照组相比，P=0.000；●与中药高剂量组比较，P=0.000；★与维生素组比较，P=0.013。

2.3.5 中药对酪氨酸酶mRNA水平的影响 组织标本抽提总RNA及RT-PCR扩增发现口服中药使豚鼠酪氨酸酶mRNA水平下降，与维生素E+C组、激光对照组和生理盐水组比较差异有统计学意义（P＜0.01），结果见表6、图1。

表6 治疗一月后豚鼠皮肤酪氨酸酶mRNA表达水平（）

表6 治疗一月后豚鼠皮肤酪氨酸酶mRNA表达水平（）

＊：与激光对照组相比，P＜0.01

光密度指数组别 n t值＊生理盐水组 10 0.57±0.09激光对照组 10 0.68±0.08维生素组 9 0.49±0.08 5.46中药高剂量组 8 0.46±0.06 6.34中药低剂量组 10 0.61±0.07 3.91

3 讨论

多年来，大量研究证实氧自由基（OFR）与皮肤黑素的形成和色素沉着关系密切[2][3]。正常情况下，体内有许多氧自由基清除剂，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化酶（GSH-PX）、谷胱甘肽（GSH）等，体内的氧化与抗氧化处于平衡状态。当脂质过氧化物（LPO）增强或自由基增多时，可使脂类形成脂质过氧化物（LPO）引起脂质过氧化作用，LPO作为启动因素使酪氨酸系列氧化反应加速，黑素形成增多；LPO极不稳定，分解产生具有强氧化作用的丙二醛（MDA），使蛋白质分子发生分子内和分子间交联.形成荧光发色团（fluorescent chromophore）即黑素。

Sichel G等[4]在试验中发现当动物肝脏中黑素含量非常高时SOD酶线粒体的活性消失了；而当肝脏中黑素含量降低时SOD酶线粒体的活性也按照比例升高。Maresca V等[5]对UV照射后黑素类型和抗氧化系统之间的可能关联进行了分析，得出结果超氧化物歧化酶和过氧化氢的活性与表皮重建的类型相关，合成的黑素能放大过氧化氢酶对特定靶目标的效应。Mastore M等[6]发现过氧（化）物酶-过氧化氢系统的加入和相关的ROI介导的反应在黑素细胞和黑素蛋白生成过程中具有明显提高作用。Wozniak A[7]在文章中指出在黑素生成的过程中自由基也在增殖，并通过研究黑素生成在B19 黑素瘤的脂质过氧化反应和在挑选出的黑色C57BL/6J小鼠组织中的抗氧化能力中的作用，发现载有移植B16黑素瘤的小鼠组织中抗氧化应激提高了。

SOD的活力高低间接反映了机体清除氧自由基的能力，而MDA的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度，因此MDA的测定常常与SOD的测定相互配合。本实验对重要的抗氧化酶SOD、CAT和与之配合的氧化酶MDA进行检测，并且发现抗氧化酶活力提高，氧化酶活力降低与黑素延迟沉着有关，再次证明了氧化酶与抗氧化酶系统在黑素产生中的作用。

在临床治疗中，皮肤科医师和美容医师经常会发现激光术后有色素沉着。多数学者认为激光术后色素沉着原因在于激光的色基也就是靶目标是黑素颗粒而不是产生黑素体的黑素细胞，所以在黑素细胞重新生成黑素颗粒之后会再次出现症状[8]。Dover JS观察到Q开关红宝石激光处理后的豚鼠皮肤在4个月后再次出现黑素沉着，并认为这说明激光治疗的靶目标即黑素仍潜在存在[9]。

本实验通过检测豚鼠血清中氧化与抗氧化酶的变化，并对豚鼠皮肤黑素沉着情况进行观察，发现了二者之间存在关联，即抗氧化酶受到抑制，而氧化酶增多时，黑素沉着发生的可能更大，程度更深；相反则黑素沉着的程度会减轻。说明在激光术后确实存在仍然可以产生黑素的黑素细胞，这与Dover JS观点一致[10]。而且可以通过调整氧化-抗氧化系统抑制激光术后的黑素沉着。

祖国医学认为色素沉着以情志不遂，劳伤脾土，肾精亏损，外受风邪为病因，与肝、脾、肾三脏关系密切，病机有肝郁气滞、脾虚肝郁、肝肾阴虚，治法为疏肝理气、化淤消斑，健脾舒肝、调和气血，滋补肝肾、育阴消斑。用药以白芷、白芨、白附子、白僵蚕、珍珠、当归、益母草、白蔹、花粉、白茯苓、荆芥、冬瓜仁、杏仁等多见[9]。李洪武等[11][12][13]通过动物和临床实验，筛选出了对黑素沉着有明显抑制作用的中药和方剂，其中白术、茯苓、山茱萸与临床常用脱色剂氢醌比较，差异无显著性（P＞0.05）。

中医认为烧烫伤后肌肤受损，伤及肌肤脉络和肌肉，气血受阻，湿浊积聚，脾肺失调，肌肤失于荣润而失色[1]。参苓白术散加减颗粒由参苓白术散衍化而来，其主要成分有黄芪、党参、白术、茯苓、山药、莲子、五味子、枸杞子、当归、桔梗等，功用益气健脾，渗湿止泻。方中黄芪，党参味甘，归脾肺经，具有补气益卫之功，共为君药；白术苦温，健脾燥湿，加强精气化生，益气助运之力；茯苓甘淡，健脾渗湿，与白术合用，效果更佳；山药，莲子助党参健脾益气；五味子能敛肺滋肾，加强君药功效；枸杞子补益肝肾，使精气充足，加强肾阳化气功能；当归甘温，补血活血效佳，为血中之气药，用在本方在于气随血生，血载气行；桔梗苦辛，归肺经，为舟楫之药，宣肺利气，以通调水道，又载药上行，以益肺气。黄芪[14]能降低血清脂质过氧化物含量，使SOD和CAT活性升高。白术[15]具有清除自由基和抑制脂质过氧化作用。有报道[16]茯苓能影响老年大鼠红细胞中超氧化物歧化酶（SOD）活性和皮肤中 SOD 活性。近年来的研究结果表明[14]，五味子中含有五味子酚、五味子丙素以及甲素、乙素等7种木脂素，对大鼠肝细胞有保护作用，能使大鼠肝细胞液中SOD和CAT活性明显提高。研究表明从枸杞子中提取出枸杞子多糖，证明其具有抗氧化作用[17]。

维生素E和维生素C具有抗氧化[17]、清除自由基[18]的作用，在临床上常用于治疗色素增加性皮肤病[19]，以及作为评价治疗黑素沉着药物疗效的标准之一[20]。本实验结果中，维生素E和C在一个月的治疗后，豚鼠激光术后皮肤黑素沉着较生理盐水组少，但SOD、CAT、MDA的改变不如参苓白术散加减颗粒的明显，说明参苓白术散加减颗粒比维生素E和维生素C抗氧化作用更强。但这也可能是因为维生素E和维生素C在体内起效缓慢，在给药时间只有一个月的情况下，维生素E和维生素C还没有完全起效所致，关于这方面研究还需要进一步的观察。

4 结论

综上，参苓白术散加减颗粒对豚鼠激光术后酪氨酸酶的表达抑制作用强于维生素E和维生素C，参苓白术散加减颗粒组SOD、CAT两种酶的活性显著高于而MDA含量显著低于其他各组，与肉眼和镜下观察到的色素沉着的程度和时间一致，证明参苓白术散加减颗粒具有很强的抗氧化作用，其作用机理可能与增强SOD、CAT的活性，抑制MDA的产生有关。可以进一步进行色素沉着皮肤病的临床疗效观察。

[1]陈杏绮，罗志军，刘鹏，等.烧伤后面部色素沉着中西医结合治疗的临床效果探讨.当代医学，2012，8（24）159-161.

[2]余春燕，韩秀珍，张宏明. 超氧化物歧化酶在不同皮肤病的变化.中国皮肤性病学杂志，1994，8（3）：153-154.

[3]唐和平，张其亮，萧嵘，等.儿茶素治疗兔外伤性黑素沉着的作用及机理初探.湖南农业大学学报，1996，22（6）：584-586.

[4]Sichel G，Corsaro C，Scalia M，et al. Relationship between melanin content and superoxide dismutase（SOD）activity in the liver of various species of animals.Cell Biochem Funct，1987，5（2）：123-128.

[5]Maresca V，Flori E，Briganti S，et al. UVA-induced modification of catalase charge properties in the epidermis is correlated with the skin phototype. J Invest Dermatol，2006，126（1）：182-190.

[6]Mastore M，Kohler L，Nappi AJ. Production and utilization of hydrogen peroxide associated with melanogenesis and tyrosinase-mediated oxidations of DOPA and dopamine.FEBS J，2005，272（10）：2407-2415.

[7]Wozniak A，Wozniak B，Drewa G，et al. Lipid peroxidation and antioxidant capacity in selected tissues of healthy black C57BL/6J mice and B16 melanoma-bearing mice.Melanoma Res，2003，13（1）：19-22.

[8]周展超.皮肤美容激光[M].南京：东南大学出版社，2000.

[9]Dover JS，Margolis RJ，Polla LL，et al. Pigmented guinea pig skin irradiated with Q-switched ruby laser pulses. Morphologic and histologic findings. Arch Dermatol，1989；125（1）：43～49

[10]尚靖，敖秉臣，刘文丽，等. 七种增白中药在体外对酪氨酸酶的影响[J].中国药学杂志，1995，30（11）：653-655.

[11]李洪武，朱文元，夏明玉. 白术等对UVB诱导豚鼠皮肤黑素沉着的抑制作用.中华皮肤科杂志，2000，33（6）：386-388.

[12]李洪武，赵健. 部分复方中药对酪氨酸酶活性影响的实验研究.江苏中医，1999，20（11）：46-47.

[13]李洪武，朱文元. 治疗黄褐斑的中药复方对酪氨酸酶活性的影响.中华皮肤科杂志，2000，33（2）：93-95.

[14]周剑. 国内对抗自由基作用中药的研究. 中国药学杂志，1992，27（9）：563-565.

[15]方允中，李文杰. 自由基与酶[M]. 北京：科学出版社，1989.

[16]于凌，徐晓东，吴景东，等. 茯苓延缓大鼠皮肤衰老作用的实验研究.辽宁中医学院学报，2003，5（1）：52-53.

[17]Vandana S，Ram S，Ilavazhagan M，et al. Comparative cytoprotective activity of vitamin C，E and betacarotene against chromium induced oxidative stress in murine macrophages. Biomed Pharmacother，2006，60（2）：71-76.

[18]Duval C，Poelman MC. Scavenger effect of vitamin E and derivatives on free radicals generated by photoirradiated pheomelanin. J Pharm Sci，1995，84（1）：107-110.

[19]Smit N，Vicanova J，Cramers P，et al.The combined effects of extracts containing carotenoids and vitamins E and C on growth and pigmentation of cultured human melanocytes.Skin Pharmacol Physiol，2004，17（5）：238-245.

[20]易运连，饶汉珍，汤爱国. 黄褐斑患者血中超氧化物歧化酶活性、丙二醛和维生素C、E含量的测定.临床皮肤科杂志，2000，29（6）：332-333.