王 芝,马如存,卓 玛,常凤霞,郝 娟,王玉清

(青海省传染病专科医院检验科,青海,810000)

近年来,结核分枝杆菌耐药率在全球范围内呈逐年上升,使得耐多药和高耐药菌株不断产生和传播,严重影响了结核病的化疗疗效,引起结核病的广泛流行[1-2]。青海是西部地区结核病疫情较重的省份之一,活动性肺结核患者约2.5万人,每年新发传染性肺结核约3500例[1]。异烟肼(INH)、利福平(RFP)与氟喹诺酮类药物是治疗结核分枝杆菌(MTB)的一线药物,临床应用广泛,但据临床调查发现近年来其耐药情况正逐渐加重[3-5]。因此,对耐INH、RFP及氟喹诺酮类药物的结核分枝杆菌katG、rpoB、gyra基因突变的特点进行检测分析很有必要。本研究采用PCRDNA测序法对我省MTB耐药分离株进行分析,以便了解katG、rpoB、gyrA等基因突变特点。

1 资料和方法

1.1 菌株来源

选取2010年06月—2012年12月在本院住院和门诊确诊为肺结核且痰培养阳性患者220例,其中女性63例,男性157例,年龄25～71岁,平均(48.17±19.65)岁。

1.2 方法

按照结核病诊断细菌学检测标准予以分枝杆菌分离培养,采用生物化学反应法进行分枝杆菌菌种地鉴定,药物敏感试验采用微量液体培养基MIC药敏快速检测法。

1.3 MTB的DNA制备

将培养阳性的结核分枝杆菌菌株用液体培养基重悬,加入玻璃珠在漩涡振荡器上磨菌5～10 min后静置10～15 min,取上层悬浊液用液体培养基比浊到1 mg/mL。从L-J培养基斜面上用接种环进行MTB菌落刮取,加入300 L的DNA裂解液中 ,进行3h的55℃水浴 ,再予95℃的水灭活5 min,加上等体积(比例为25∶24∶1的酚-氯仿-异戊醇)抽提2次,加50L双蒸水进行溶解,-20℃温度中保存以备用。

1.4 PCR扩增

采用50 L反应体系,扩增参数:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,退火1 min(退火温度katG为64℃,gyrA 60℃,rpoB 60℃),72℃延伸1 min,予以 30次循环;然后72℃延伸10 min。经1%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测[6]。

1.5 DNA序列测定

DNA序列测定与分析采用中山大学达安基因股份有限公司生产的PCRDNA纯化试剂盒提纯PVR扩增产物,送上海生物工程公司测序。测序仪器选用ABI PRISM 3700,测序试剂选用BigDye terminatorv 3.1,使用DNASTAR与ClustalX 1.81软件辅助分析。

2 结 果

2.1 耐药率及基因突变情况

从220例本院住院和门诊确诊的肺结核病人痰液中分离出77例MTB,对3种药耐药情况为:INH耐药率40.26%(31/77),RFP耐药率31.17%(24/77),氟喹诺酮类药物耐药率为8.57%(22/77),在耐单一药中以耐INH为首。

耐药株基因突变情况如下:耐INH菌株中,katG基因突变率为 70.97%;耐 RFP菌株中,rpoB基因突变率为83.33%;耐氟喹诺酮类药物菌株中,gyra基因突变率为77.27%。见表1。

表1 100例分离MTB耐药及基因突变情况[n(%)]

2.2 DNA测序

katG最常见的突变形式为Ser 315 Thr(86.67%);rpoB最常见的突变形式为526、531位氨基酸改变,总突变率为72.73%;氟喹诺酮类药物突变主要在gyrA基因耐药决定区(QRDR)发生,突变位点主要为94(65.00%)。见表2。

3 讨 论

近年来,由于多重耐药结核的广泛存在,对结核病的治疗产生严重影响,结核病的临床控制也变得越来越艰辛和复杂,早期诊断和快速识别多重耐药结核对结核病的传染控制和治疗至关重要[7]。

表2 基因突变DNA测序突变特征[n(%)]

本研究结果中,本院220例MTB临床分离株对3种药的耐药率分别为INH55.5%(122/220)、RFP35.0%(77/220)、氟喹诺酮类药物34.5%(76/20),提示青海地区在耐单一药中以INH耐药率较高,说明青海地区临床使用INH频率较高。

3.1 MTB异烟肼耐药katG基因突变特点

异烟肼作为一线治疗结核病的药物,其作用机制较为复杂,至今尚不明确。现已阐明:异烟肼主要是由MTB的KatG基因活化为具有杀菌活性的异烟酸、异烟胺而发挥作用[8]。有报道在1992年已经证实,KatG是MTB中具有活化异烟肼作用的一种酶,继之又证实了MTB耐异烟肼与katG基因突变之间的关系[9-10]。katG由744个氨基酸残基所构成,全长2223 bp,有研究报道其常见的突变位点为第315、463位密码子。

本研究56株耐INH药株中,katG基因突变率为71.4%;在 315位点,AGC※ACC(Ser※Thr)突变 25株(62.5%),ACG※AAC(Ser※Asn)突变6株(15.0%)等,即katG最常见的突变形式为Ser315Thr(62.5%),与上述报道基本一致。

3.2 MTB利福平耐药rpoB基因突变特点

利福平是通过与MTB的 RNA聚合酶B亚基(简称rpoB)相结合,对转录起始复合物形成具有抑制作用,从而干扰细菌转录,产生杀菌作用[11]。如果 RNA聚合酶81 bp核心区发生突变,利福平则无法与作用靶位rpoB相结合,由此而产生细菌的耐药[12]。

相关报道指出,第531位氨基酸是最易发生突变的位点[13]。本研究耐药株rpoB基因突变全部集中发生在81 bp核心区。35株利福平耐药株密码子TCG※T TG(Ser※Leu)在531位点突变11株(31.4%),526位点突变14株(40.0%),516位点突变3株(8.6%),其他6株(17.1)。这也再次印证了绝大部分耐RFP菌株与rpoB基因耐药决定区的突变有关,最常见突变位点在第526、531位密码子。

3.3 MTB耐氟喹诺酮类药物菌株中gyrA基因突变特点

氟喹诺酮类药物中有很多能起较强抗MTB活性的药物,但随着近年来临床的广泛应用,细菌耐药性问题亦日渐突出。其主要通过抑制细菌DNA回旋酶活性,松弛细菌双链超螺旋结构,使得双链无法被部分拆开,细菌DNA修复和合成无法完成,导致最终死亡[14]。绝大部分获得性耐药与DNA回旋酶A亚单位(简称gyrA)基因突变有关[15]。

本文研究结果显示,在耐氟喹诺酮类药物菌株中,gyra基因突变率为75%,氟喹诺酮类药物突变主要在gyrA基因耐药决定区(QRDR)发生,突变位点主要为94(66.7%)、90(10%)、91点(6.7),其他16.7%,说明氟喹诺酮类药物产生耐药的主要机制为gyrA基因QRDR突变,突变位点主要在90、91、94位点。

katG、gyrA、rpoB基因突变为青海地区结核分枝杆菌INH、氟喹诺酮类药物以及RFP耐药所引起的主要分子机制,应用操作简单的PCRDNA测序法,可作为临床快速检测结核分枝杆菌INH、氟喹诺酮类药物、RFP耐药性的辅助手段。

本研究确诊的肺结核患者来自青海省不同地区,包括牧区藏族、农村及市区,按照地区来源对样本进行分类,并对drpoB、katG、gyrA耐药基因位点突变特征进行比较,未能发现地区之间的耐药基因突变位点存在显著差异。

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