周禄斌，连芳青

(江西农业大学 园林与艺术学院，江西 南昌 330045)

仙鹤草为蔷薇科植物龙芽草(Agrimonia pilosa Ledeb.)的干燥地上部分。龙芽草始载于《滇南本草》，又称仙鹤草、金顶龙芽、脱力草、狼芽草;其根芽为鹤草芽。仙鹤草性平，味苦、涩，归心、肝经，有收涩止血，截疟，止痢，解毒之功效。用于咯血，吐血，崩漏下血，疟疾，血痢，脱力劳伤，痈肿疮毒，阴痒带下［1］。现代医药研究，仙鹤草中含有仙鹤草素、仙鹤草内酯、鞣质、鹤草酚等酚类化合物和黄酮类等化合物，具抗肿瘤、抗炎镇痛、降血糖、降血压、增强机体免疫功能等作用［2－3］。另外，仙鹤草还是我国常用的野菜［4］，在中药兽药方面也发挥着重要作用［5］。随着仙鹤草研究的深入，使用量逐步增加，野生药材及传统的栽培方式将不能满足其需要，因此，通过植物组织培养提取有效成分无疑是行之有效的解决办法［6］。

近年来，用组织或细胞培养技术进行药用植物次生代谢产物(有效成分)的生产取得了很大进展，特别是人参、紫草、红豆杉等几种药用植物的细胞培养已经达到了工业化生产规模。本实验采用正交设计的方法，以愈伤组织产量和总黄酮含量作为评价指标，对仙鹤草愈伤组织诱导、增殖培养基进行优化筛选，比较不同的理化因子对仙鹤草愈伤组织生长的影响，筛选出仙鹤草愈伤组织诱导、增殖及高含量总黄酮的最佳培养条件，为工业化生产仙鹤草总黄酮类化合物提供参考及高含量总黄酮体细胞无性系的建立提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

野生仙鹤草瘦果采于本校植物标本园。

1.2 实验方法

1.2.1 无菌苗的获得 收集仙鹤草成熟果实，取出种子。挑选出健康、饱满的种子，分成两组。然后，以体积分数为75%酒精10 s，升汞2 min对两组种子进行消毒处理。接种于MS基本培养基中，自然光照，(25±1)℃条件下培养，观察发芽情况。

1.2.2 愈伤组织的诱导 待幼苗抽出第一片真叶时，选择生长良好的无菌幼苗子叶，并将各子叶对半切开。将所有子叶分别随机地接入配置好的无菌培养基中(表1，琼脂7 g/L，蔗糖30 g/L)，每瓶培养基接2个半片，一片正面(向阳面，下同)朝上，一片正面朝下。各实验号重复24瓶。于(25±1)℃条件下，遮光培养。一个月后，统计愈伤组织诱导率。

表1 诱导培养基各因素水平Tab.1 Factors and levers for callus induce

1.2.3 愈伤组织的增殖 选择长势良好的愈伤组织随机地接入各增殖培养基中(表2，琼脂7 g/L，pH 6.0，蔗糖30 g/L)。各实验号重复20瓶，于(25±1)℃条件下遮光培养，一个月后，观察愈伤组织增长情况。

1.2.4 愈伤组织总黄酮含量的测定 对各增殖的愈伤组织进行继代培养2次，每次培养40 d，继代培养基与增殖培养基保持一致。然后，将增长量较大的几个实验号中的愈伤组织取出，用蒸馏水洗去培养基及坏死部分，烘干。总黄酮含量测定方法参照方桂珍，孙晓轶等［7］进行，以实验组为参比 ，采用紫外分光光度法，在510 nm处测定相对吸光度。各称取1.5 g，按液料比10∶1量取体积分数40%乙醇液，混于圆底烧瓶中，置于70℃水浴锅中回流0.5 h后，过滤。将滤渣再次按同样的方法连续回流2次，每次0.5 h，合并滤液，浓缩，即得总黄酮提取液。精密量取提取液1 mL，加入体积分数30%乙醇4 mL，再加入5 mg/mL亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，再加入5%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加1 mol/L NaOH溶液4 mL，用水定容至10 mL，摇匀，放置15 min。置比色皿中，用UV755B分光光度计在510 nm波长下测定吸光度。

1.3 计算方法

实验采用了5因素、5水平的L25(56)正交设计实验分析愈伤组织诱导影响;采用3因素，3水平的L9(34)正交设计实验分析增殖影响。统计分析均使用SPSS15.0进行。

2 结果与分析

2.1 不同接种方式对愈伤组织诱导的影响

子叶接种后10 d，正面朝下接的子叶伤口处开始膨胀。两周左右，出现淡黄色愈伤组织。对两种接种方式的子叶观察统计发现，正面朝下接的方式长出愈伤组织在时间上比正面朝上接的要提前4～6 d，且总的诱导出愈伤组织的比例也要高。在诱导的过程中，发现子叶有向反面卷曲的趋势，这一点在用叶片做外植体时表现的尤为明显(图1)。

图1 叶片不同接入方式的愈伤组织诱导Fig.1 Callus induce in both blade inoculate method

2.2 不同培养条件对愈伤组织诱导的影响

愈伤组织的诱导受培养条件的影响。一个月后，对愈伤组织诱导情况进行统计(表3)。结果表明，各因素对愈伤组织诱导的影响中，以6－BA影响最大，NAA其次。而2，4－D、pH及大量元素的影响均较小。方差分析结果(表4)同样表明，6－BA和NAA两因素水平间有统计学差异(P＜0.05)。LSD多重比较发现，对于6－BA，水平2、3、4间，诱导率没有显著性差异，但要显著高于1、5水平;对于NAA，水平1、2、3、4间，诱导率没有显著性差异，但要显著高于5水平。结合愈伤组织的诱导量考虑，最终确认仙鹤草愈伤组织最佳诱导培养基为:1/2MS+6 －BA 1.0(mg/L)+NAA 0.5(mg/L)，pH 6.0 ～6.5。

2.3 不同培养条件对愈伤组织增殖的影响

30 d后，根据各实验号中愈伤组织增长量，统计分析如表5、表6。方差分析结果显示大量元素项P=0.034＜0.05，有统计学意义，说明大量元素各水平间有差异，其余两个因素没有显著性差异。由表5可以得出，愈伤组织增殖最优方案为A2B3C1，但在9次实验中未出现。实验中5、6、9这3个实验号均出现最高长势(图2)，这说明分析出的最佳方案是比较符合实际的。同时，鉴于经济因素，愈伤组织增殖最佳培养基定为:1/2MS+6 －BA 2.0(mg/L)+NAA 1.0(mg/L)，pH 6.0，蔗糖 30 g/L。

2.4 愈伤组织总黄酮含量的测定

取长势最好的5、6、9这3个实验号中所有重复的愈伤组织进行总黄酮的提取。在510 nm波长下，测量各组相对吸收。以一组为参比，测量另外两组相对吸光度，结果发现3个实验号中的吸光度以6号最低，总黄酮含量依次为5号＞9号＞6号。即在1/2MS+6－BA 2.0(mg/L)+NAA 1.0(mg/L)，pH 6.0，蔗糖30 g/L培养体系中培养的愈伤组织所含总黄酮量最多，与最佳增殖培养条件一致。

3 讨论

(1)不同接种方式对愈伤组织的诱导具有一定的影响。薛建平等［8］以亳菊、贡菊、滁菊脱毒苗叶片为外植体，发现叶片背面接入诱导植株再生明显优于正面接入;但赵妮等［9］以君子兰叶片为材料，发现叶片采用正面向下的接种方式，在延长叶片的培养时间、防止“褐变”的发生方面明显优于其他接入方

式。也有认为叶片正面接入与反面接入无明显差异，如王建湘［10］的草莓组织培养。正接与反接的影响，得出结果不尽相同，可能与外植体本身有关。本实验对子叶采用两种不同接种方式，表现为子叶正面朝下比正面朝上接入更易诱导出愈伤组织。在诱导的过程中，发现子叶有向反面卷曲的趋势，这一点在用叶片做外植体时表现的尤为明显，如图2。正面朝下接，叶片向上反卷。为避免叶片因卷曲而与培养基脱离，接种时，建议将叶片中央划破，这样可使得培养基更易被吸收。

表3 不同培养基愈伤组织诱导情况Tab.3 The statistics of callus induce on different culture medium

表4 愈伤组织诱导方差分析Tab.4 Variance analysis of callus induced

表5 不同培养基愈伤组织增殖情况Tab.5 The statistics of callus proliferate on different culture medium

表6 愈伤组织增殖方差分析Tab.6 Variance analysis of callus proliferate

图2 增殖中的愈伤组织Fig.2 Callus in proliferating

(2)植物愈伤组织的诱导、增殖受很多因素的相互影响。实验采用正交设计实验方法，可以实现以少量的实验次数来完成多种因素多个水平产生的影响。然而，正交实验得出的结果只不过是一个理论上的统计结果，实际应用中还应考虑多种外在因素的综合效应。因此，本实验在综合考虑诱导率与诱导量的前提下，没有选择统计分析得出的结果，而是选择了6－BA 1.0(mg/L)的方案。

(3)植物中的次生代谢产物含量受到很多因素的影响。本文只是考察了最基本的盐离子浓度和外源激素的影响，保证愈伤组织增长量的前提下选择有效成分含量相对较高的配比。可以在基本培养条件确定后，进一步尝试通过液体摇床培养，添加前提诱导物等一系列手段来提高其中有效成分含量，达到大规模生产要求。

(4)本实验对愈伤组织只做了总黄酮含量的分析，至于其它成分的影响还有待研究。文中总黄酮含量测定的方法与陈优生［11］所报道的方法有较大差异，似乎说明不同材料同一种有效成分其所使用的提取方法也有所差异。至于文中以愈伤组织为材料进行总黄酮含量测定的方法，还没有相关报道。但由于本文只是以总黄酮含量作为一个指标来指导筛选出有效成分含量相对高的培养条件，所以也就没有必要一定找出一种适合于提取仙鹤草愈伤组织总黄酮的方法。同时，由于本文所做的只是一个相对含量的测定，以实验组相互对照，所以还不能判断通过该种不同培养条件的变化来影响其有效成分含量的方法得出的含量是否能达到或超过野生状态。本文对总黄酮的含量也只是一个很粗放的测定，如果条件允许，可以进一步使用HPLC等手段进行各种单体的含量检测比较。

［1］中华人民共和国药典委员会.中国药典(一部)［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:53.

［2］洪阁，戴永红.仙鹤草化学成分和药理作用研究进展［J］.药学服务与研究，2008，8(5):362－366.

［3］巴晓雨，何永志.仙鹤草研究进展［J］.辽宁中医药大学学报，2011，13(5):258 －261.

［4］陈茂花.我国常用野菜简介［J］.生物学教学，2002，27(6):44 －46.

［5］吴周水.仙鹤草在兽医临床上的应用［J］.江西畜牧兽医杂志，1998(5):32－32.

［6］高文远，贾伟.药用植物大规模组织培养［M］.北京:化学工业出版社，2005:57－118.

［7］方桂珍，孙晓轶.正交实验法优选仙鹤草中总黄酮的提取工艺［J］.林产化学与工业，2002，22(3):62－64.

［8］薛建平，张爱民.安徽药菊叶片直接再生植株技术的研究［J］.中国中药杂志，2004，29(2):132－135.

［9］赵妮，邹志荣.君子兰叶片组织培养研究初报［J］.陕西农业科学，2005(4):51－52.

［10］王建湘.草莓组织培养叶片再生技术研究［D］.长沙:湖南农业大学，2004.

［11］陈优生，张焜.正交试验优选仙鹤草中总黄酮提取工艺［J］.安徽医药，2010，14(12):1389－1390.