韩宏光，王辉山，韩劲松，汪曾炜，尹宗涛

缺血预适应(IPC)是指经历了短暂性缺血后的心肌会对随后发生的持续的、更为严重的缺血产生保护作用，目前被认为是最有效的一种心肌保护方式[1]。IPC对心肌的保护作用目前普遍认为与信号传导机制有关，但确切机制尚待进一步深入研究。既往关于IPC的研究多数限于健康心肌，而对糖尿病心肌的研究较少。有研究表明，一氧化氮(NO)参与了急性期IPC[2]。本研究在既往血糖正常大鼠研究[3]的基础上，应用大鼠在体缺血再灌注模型，观察糖尿病心肌IPC后NO、环磷酸鸟苷(cGMP)及一氧化氮合酶(NOS)含量的变化，为进一步深入研究IPC信号传导机制寻找理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂 健康雄性SD大鼠购自沈阳军区总医院，体重260～330g。腹腔注射链佐星(STZ，Sigma公司，60mg/kg)制作糖尿病大鼠模型，2d后测血糖≥11.1mmol/L为造模成功。所有大鼠饲养条件一致，2周后行动物实验。NO、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，cGMP放免分析试剂盒购自上海中医药大学同位素室。

1.2 在体左冠状动脉阻断模型的制备 10%水合氯醛(0.4ml/100g)腹腔注射，麻醉成功后气管插管，呼吸机辅助(呼吸机设定条件：潮气量1.5ml/100g，呼吸频率70～80次/min，吸呼比1:1.5)，心电监测。逐层入胸，切开心包、悬吊，显露左冠状动脉，在左冠状动脉下穿线，用聚乙烯小管穿过缝线两端，拉紧小管并固定，制作心肌缺血模型，松开小管即为再灌注模型。左室前壁呈蓝紫色或发绀、心电图提示ST段抬高为缺血模型成功标志。实验动物剔除标准：左室壁颜色、ST段改变不明显以及出血较多者。

1.3 实验分组 取糖尿病与血糖正常大鼠各30只，分别采用随机数字法分为3组，每组10只。假手术(Sham)组：左冠状动脉下穿线后，仅套环但不收紧小管，维持155min；缺血再灌注(I/R)组：左冠状动脉下穿线后平衡35min，收紧小管，维持30min，再松开小管，维持90min；IPC组：左冠状动脉下穿线后平衡35min，收紧小管，维持5min，再松开小管，灌注5min，重复进行3次，持续收紧结扎造成缺血30min，放松后再灌注90min。

1.4 各项指标检测 采用全自动生化分析仪测定各组血清中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)和肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)的含量。取心尖肌0.5g制成10%组织匀浆，采用TBA法测定MDA含量，邻苯三酚自氧化法检测SOD活性，放免法检测cGMP含量，结果以pmol/g表示。采用硝酸还原酶法于波长530nm处测量心肌组织匀浆上清液吸光度(A)值，计算NO和NOS含量，结果用μmol/g prot和U/mg pro表示。

1.5 心肌线粒体Flameng评分 制作心肌组织电镜切片，对线粒体进行Flameng评分[4]。方法：每组随机观察5个视野(每视野中20个线粒体)，计算每个视野中线粒体评分的平均数，5个视野的均值即为Flameng评分。

1.6 统计学处理 采用SPSS 11.5软件进行统计分析，数据结果以表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，进一步两两比较采用SNK-q法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血糖浓度比较 制备的糖尿病大鼠血糖浓度为15.8±4.5mmol/L，非糖尿病大鼠血糖浓度为4.3±1.3mmol/L，两组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.2 血清CK、CK-MB和LDH含量变化 在非糖尿病大鼠，I/R组及IPC组血清CK、CK-MB、LDH含量均明显高于Sham组(P＜0.05)，且I/R组明显高于IPC组(P＜0.05)；在糖尿病大鼠，IPC组及I/R组CK、CK-MB、LDH含量明显高于Sham组(P＜0.05)，而I/R组与IPC组比较差异无统计学意义(P＞0.05，图1)。

2.3 心肌组织MDA、SOD含量比较 在非糖尿病大鼠，IPC组心肌MDA含量与I/R组比较明显降低(P＜0.05)，SOD含量与I/R组比较明显增高(P＜0.05)。而在糖尿病大鼠，两组比较差异无统计学意义(P＞0.05，图2)。

2.4 心肌NO、cGMP、NOS含量比较 在非糖尿病大鼠中，与I/R组比较，IPC组心肌NO、cGMP、NOS含量明显增加(P＜0.05)，而在糖尿病大鼠中，IPC组与I/R组比较差异无统计学意义(P＞0.05，图3)。

2.5 线粒体超微结构比较 非糖尿病大鼠IPC组Flameng评分(0.33±0.04)较Sham组(1.50±0.60)和I/R组(1.63±0.15)明显降低(P＜0.05)；糖尿病大鼠IPC组Flameng评分(1.65±1.33)和I/R组Flameng评分(1.68±0.03)均高于Sham组(0.95±0.02， P＜0.05)，但IPC组与I/R组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。Sham组及IPC组线粒体双层膜存在，无明显肿胀，胞核正常。非糖尿病IPC组线粒体中度肿胀，嵴稀疏、紊乱，核膜出现皱褶。糖尿病大鼠I/R组及IPC组线粒体重度肿胀，嵴稀疏、断裂，呈空泡样改变，核膜皱褶明显(图4)。

图1 血清CK、CK-MB和LDH含量比较Fig.1 CK, CK-MB and LDH content in serum

图2 心肌组织MDA、SOD含量比较Fig.2 MDA and SOD content in myocardial tissue

图3 心肌NO、cGMP、NOS含量比较Fig.3 NO, cGMP and NOS content in myocardial tissue

图4 线粒体超微结构比较Fig.4 Comparison of ultra-microstructure of the mitochondria

3 讨 论

目前有关糖尿病对IPC的影响及其机制的研究较少。有研究表明，IPC在糖尿病大鼠心肌的保护作用受抑制可能与心肌胰岛素抵抗有关[5-6]，但其机制可能不止一种。本研究通过在体左冠状动脉阻断模型探讨IPC在糖尿病大鼠心肌的保护作用减弱与NO-cGMP信号通路的关系，结果显示，在非糖尿病大鼠中，IPC后心肌组织SOD增加、MDA减少、心肌酶漏出减少，导致NO、cGMP、NOS含量明显增加，而在糖尿病大鼠中，IPC后大鼠心肌酶漏出、MDA、SOD均无明显差异，NO、cGMP、NOS含量亦未见明显增加。Bandyopadhyay等[7]认为，I/R后氧自由基(ROS)生成过多，SOD含量降低，可导致MDA增加，膜脂质过氧化，从而进一步加重心肌细胞损伤。本研究发现IPC组大鼠心肌线粒体的损伤未较I/R组明显减轻。因此，推测IPC在糖尿病大鼠心肌保护作用减弱可能与NO-cGMP信号通路在糖尿病心肌中的表达受到抑制有关。

目前，较为公认的IPC机制是细胞内信号传导途径，一般分为触发物质、中介物质和效应子3个环节[8]。触发物质包括NO、前列腺素、腺苷、缓激肽等，中介物质为蛋白激酶C(PKC)，效应子主要为KATP通道。NO产生的反应性氧物质可能是激发产生IPC的信号物质，内源性NO能与SOD竞争，灭活基础状态下产生的超氧自由基[9]。再灌注前予以NO供体，改善心肌收缩性，可缩小心肌梗死范围[10]。Han等[11]研究证实NO-cGMP信号可以激活KATP通道。某些NO供体药物能够增强KATP通道及其开放剂如二氮嗪的活性[12]，这一作用是通过可溶性鸟苷酸环化酶的激活使cGMP含量增加，再通过磷酸肌醇反应以及激活cGMP依赖蛋白激酶两条途径激活PKC，导致KATP通道活化而实现的[13]。NO作为一种信号分子可通过cGMP-蛋白激酶途径[14]降低细胞内Ca2+浓度，导致血管平滑肌松弛并阻止血小板聚集[15-16]、中性粒细胞黏附等。

高血糖可使线粒体生成超氧化物增多，后者可与NO发生化学反应生成过氧化氮，从而降低NO的保护作用。高血糖状态还可通过抑制内皮型NOS使NO生成减少。糖尿病时由于糖异生作用加强，葡萄糖摄取和氧化功能发生障碍，细胞内积聚大量甘油三酯和游离脂肪酸等脂滴颗粒，最终导致KATP通道活性降低。

总之，本研究推测IPC对糖尿病大鼠心肌的保护作用受抑制，其机制可能与NO-cGMP信号通路表达在糖尿病心肌中受到抑制有关，进而影响信号传导中相关激酶或辅酶激活因子或KATP通道的活性，使IPC在糖尿病心肌中不能发挥有效的心肌保护作用。当然，糖尿病大鼠和非糖尿病大鼠由于血糖存在的显著差异，也可能对心肌代谢有一定影响，相关研究仍需进一步深入。

[1]Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia：a delay of lethal cell injury in ischemicmyocardium[J]. Circulation, 1986, 74(5): 1124-1136.

[2]Lochner A, Mantis E, Genade S, et al. Nitric oxide：a trigger for classic preconditioning[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol ,2000, 279(6): H2752-H2765.

[3]Han HG, Wang ZW, Zhang NB, et al. The roles of nitric oxide during early phase of myocardial ischemic preconditioning in rats[J]. Chin Med J, 2008, 121(13): 1210-1214.

[4]Flameng W, Borgers M, Daenen W, et al. Ultrastructual and cytochemical correlates of myocardial protection by cardiac hypothermia in man[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 1980, 79(3):413-424.

[5]Han JS, Yan DM, Zhu HY, et al. Influence of diabetes on the protective effect of ischemic preconditioning on ischemic reper fused rat heart[J]. Med J Chin PLA, 2008, 33(10): 1195-1197. [韩劲松,阎德民, 朱洪玉, 等. 糖尿病对大鼠心肌缺血预处理保护作用的影响[J]. 解放军医学杂志, 2008, 33(10): 1195-1197.]

[6]Han JS, Han HG, Wang HS, et al. Influence of diabetes on myocardial ischemic preconditioning and its mechanism[J].Med J Chin PLA, 2011, 36(5): 463-466. [韩劲松, 韩宏光, 王辉山, 等. 糖尿病对缺血预适应大鼠心肌缺血再灌注的影响及其机制研究[J]. 解放军医学杂志, 2011, 36(5): 463-466.]

[7]Bandyopadhyay D, Chatopadyay A, Ghosh G, et al. Oxidative stress-induced ischemic heart disease：protection by antioxidants[J]. Curr Med Chem, 2004, 11(3): 369-387.

[8]Murphy E. Primary and secondary signaling pathways in early preconditioning that converge on the mitochondria to produce cardioprotection[J]. Circ Res, 2004, 94(1): 7-16.

[9]Jeferey M, Park TS, Giddy JM, et al. Modulation of basal and postischemic leukocyte-endothelial adherence by nitric oxide[J].Stroke, 1998, 29(7): 1423-1430.

[10]Pabla R, Buda AJ, Flynn PM, et al. Intracoronary nitric oxide improves postischemie coronary blood flow and myocardial contractile function[J]. Am J Physiol, 1995, 269(3Pt2): 1113-11 21.

[11]Han J, Kim N, Joo H, et al. ATP-sensitive K(+) channel activation by nitric oxide and protein kinase G in rabbit ventricular myocytes[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2002,283(4): H1545-H1554.

[12]Oldenburg O, Qin Q, Kriegg T, et al. Bradykinin induces mitochondrial ROS generation via NO, cGMP, PKG, and mitoKATP channel opening and leads to cardioprotection[J].Am J Physiol, 2004, 286(1): H468-H476.

[13]Shiono N, Rao V, Weisel RD. L-arginine protects human heart ceils from low-volume anoxia and reoxygenation[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2002, 282(3): H805-H815.

[14]Ruiz-Stewart I, Tiyyagura SR, Lin JE, et al. Guanylyl cyclase is an ATP sensor coupling nitric oxide signaling to cell metabolism[J ].Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(1): 37-42.

[15]Liu HY, Hu XC, Zhang DY. Relationship between nitric oxide release from pig iliac endothelial cells caused by Exendin-4 and change in intracellular calcium[J]. Med J Chin PLA, 2012,37(9): 859-863. [刘浩宇, 胡小春, 张冬颖, 等. Exendin-4介导的猪髋动脉内皮细胞NO释放与细胞内钙离子浓度变化的关系[J]. 解放军医学杂志, 2012, 37(9): 859-863.]

[16]Xu YX, Zhang RZ, Wang DX, et al. Effects of L-carnitine on the contents of MPO and NO in rats with renal ischemic reperfusion injury[J]. Zhengzhou Univ (Med Sci), 2012, 47(6): 810-813.[许益笑, 张睿, 王德选, 等. 左卡尼汀对肾缺血再灌注损伤大鼠肾组织MPO和NO含量的影响[J]. 郑州大学学报(医学版), 2012, 47(6): 810-813.]