★ 王飞 黄佩蓓 曾贤 揭辉洋 余春波

(江西中医学院 南昌 330004)

白木通基因组DNA提取方法研究*

★ 王飞**黄佩蓓***曾贤 揭辉洋 余春波

(江西中医学院 南昌 330004)

以白木通新鲜叶片为材料，采用改良CTAB法提取DNA，并对提取的DNA进行了纯度鉴定和PCR检测。结果表明：改良的CTAB提取法，能够有效去除次生物质对DNA的干扰，提高提取DNA的质量和纯度，适宜白木通叶片DNA的提取。该改良法提取的DNA可用于SRAP分析。

白木通；DNA提取

白木通(Akebiatrifoliata(Thunb.)Koidz.var. Australis(Diels))为木通科木通属落叶木质藤本植物，是《中华人民共和国药典》[1]收载的珍稀濒危中药材原植物。为了保证其可持续性利用，有必要进行其种质资源遗传多样性研究，而获取高质量的基因组DNA是进行种质资源遗传多样性研究的基础。[2]不同的植物由于体内色素、酚类和多糖等次生物质的含量不同，其所需要的DNA提取方法不同。[3]目前，提取植物基因组DNA的方法有CTAB法、SDS法、、高盐低pH法、碱裂法、苯酚法、热解法、试剂盒提取DNA的方法等。[4]CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)因可有效地去除样品中的蛋白质、多糖等杂质，是植物中常用的DNA提取方法。本研究以白木通新鲜叶片为提取材料，采用改良CTAB法提取白木通基因组DNA，以期获得高质量的基因组DNA，为进一步的白木通种质资源遗传多样性研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料

试验材料采自江西井冈山，经赖学文教授鉴定，移植保存于江西中医学院神农园。

1.1.2 仪器与试剂

仪器：XPcycler-PCR(BIOER)、核酸蛋白测定仪(Eppendorf)、JM-250电泳仪(Jim-X)、电泳槽(Jim-X)、H-1650高速离心机(xiang yi)、凝胶成像分析仪(Alpha Innotech)、HH-S数显恒温水浴锅。试剂：CTAB(BBI)、PVP(BBI)，EDTA(BBI)、Tris(BBI)、Agarose(BBI)，其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 提取方法

称取白木通新鲜叶片0.1g于研钵中，加入适量PVP粉末，迅速倒入液氮研磨成干粉状，然后将干粉转移至1.5mL离心管中，并加入预热的2×CTAB提取液(2%CTAB，100mmoL/L Tris-Cl pH8.0，20 mmol/L EDTA pH8.0，1.4 mol/L NaCl, 2%β-巯基乙醇)750μL混合均匀，65℃水浴90min，每10min颠倒离心管1次，使沉淀充分溶解。取出离心管，冷却至室温。加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)充分混匀，12 000 r/min离心5min。取上清液至干净离心管中，吸取上清液，加入等体积氯仿：异戊醇(24∶1)抽提2次。取上清到1.5 mL离心管，加入2倍体积的无水乙醇，4℃沉淀10min后，1 2000r/min，离心3min。弃上清，沉淀用70%酒精洗涤2-3次，室温干燥1h后，用适量灭菌TE缓冲液溶解之，-20℃储存或放入4℃冰箱待用。

1.2.2 DNA浓度检测

DNA稀释后于核酸蛋白测定仪上检测浓度，体系为1μLDNA样品加入99μL蒸馏水。DNA浓度、A260/A280直接从仪器上读出，取3次数值的平均值。

1.2.3 DNA质量检测

取2μLDNA样品于0.8%的琼脂糖凝胶上电泳检测。电压80V，在染料到达胶面的2/3时取出，置于紫外透射仪中观察，并拍照分析。

1.2.4 SRAP-PCR检测

取白木通基因组DNA样品2μL进行SRAP-PCR检测。PCR反应体系如下：模板DNA100ng，前引物0.2μM，后引物0.2μM，Taq酶1U，10×PCR Buffer2.5 mM， dNTPs(200μM)，灭菌蒸馏水补足至总体积25μL。反应程序为：94℃预变性3min；94℃ 1min，35℃ 1min，72℃ 2min，5个循环；94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1min，35个循环；72℃延伸10min。取PCR产物10μL于2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 DNA浓度与质量

从表1可看出，采用改良CTAB法提取的白木通新鲜叶片基因组DNA质量较好。DNA浓度在45-50 μg/mL之间，A260/A280在1.79～1.89之间，说明提取的DNA较纯，蛋白、酚类等杂质污染较少；琼脂糖凝胶电泳结果表明DNA样品的电泳谱带明亮清晰、无拖尾，且点样孔干净，说明多糖、蛋白质污染较少(见图1)。

表1 白木通叶片提取的DNA浓度与A260/A280

图1 改良CTAB法提取的白木通新鲜叶片DNA电泳图

2.2 白木通DNA SRAP-PCR检测

如图2所示，样品的SRAP-PCR分析结果显示，改良CTAB法提取的DNA的扩增产物条带清晰，多态性好。由此可见，改良CTAB法提取的DNA适于进行样品SRAP分析。

3 讨论

白木通叶片含有较多的酚类和多糖等次生代谢物质，特别是老叶，提取基因组DNA常常出现褐化、沉淀呈胶状现象。本法采用改良2×CTAB法,新鲜叶片不剪碎加入适量PVP粉末和液氮一起研磨，同时β-巯基乙醇的用量加大至2%；另外，在充分研磨的基础上，还将水浴锅保温时间延长至90min。通过改良有效地去除了酚类、多糖物质，获得了高质量的白木通基因组DNA，研究结果表明，该改良法提取的DNA适于SRAP研究，且该法使用普通离心机抽提DNA，方法简便、经济。

[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)[S].北京:化学工业出版社，2005：43．

[2]李金璐，王硕，于婧，等．一种改良的植物DNA提取方法[J].植物学报，2013，48(1)：72-78．

[3]申丹，曾杰，周世良，等．4种石山植物DNA提取方法筛选[J].广西科学，2005，12(4)：340-342．

[4]王关林，方宏筠．植物基因工程[M].北京：科学出版社，2002：533-535．

MethodforExtractingGenomicDNAfromLeavesofAkebiaTrifoliata(Thunb.)Koidz.var.Australis(Diels)*

WANGFei**,HUANGPei-bei***,ZENGXian,JIEHui-yang,YUChun-bo

JiangxiUniversityoftraditionalChineseMedicine,JiangxiNanchang330004

With fresh leaves ofAkebiatrifoliata(Thunb.)Koidz.var. Australis(Diels)as materials, the modified CTAB method is adopted to extract DNA. The purity test and the PCR test were conducted to the DNA. The results showed that it can effectively eliminate the interfere of secondary substances to DNA and improve quality and purity of extracted DNA when CATB method was modified. The modified CTAB method is suitable for extracting DNA from fresh leaves ofAkebiatrifoliata(Thunb.)Koidz.var. Australis(Diels), and the extracted DNA can be used in SRAP analysis．

AkebiaTrifoliata(Thunb.)Koidz.var. Australis(Diels)；DNA Extraction；

江西中医学院研究生创新基金项目(项目编号：JZYC12C01),江西中医学院2012年国家级大学生创新创业训练计划项目(项目编号：201210412024)。

**作者简介：王飞(1988-),女,浙江杭州人,在读硕士研究生,主要从事中药分子生物学研究,E-mail:Lv.19.88@163.com。

***通讯作者：黄佩蓓(1964-),女,浙江江山人,教授,硕士研究生导师,主要从事中药生化研究,E-mail:hhhpei@tom.com。

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2013-11-07)