马珍，李吕木，，许发芝，丁小玲，钱坤，徐雅芫，陈丽园，张莉，陈文帮

1(安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽 合肥，230036)

2(安徽农业大学动物科技学院，安徽 合肥，230036)

3(安徽省畜牧生物工程技术研究中心，安徽 合肥，230031)

4(安徽省兽药饲料监察所，安徽 合肥，230022)

棉粕为棉籽去油后的副产品，富含蛋白质。但由于其中含有游离棉酚等抗营养因子，限制了棉粕在动物生产中的广泛应用。因此，有效去除或降低棉粕中的棉酚，是改善其饲用品质的关键。目前主要通过物理法、化学法、生物发酵法来降低或去除棉粕中的游离棉酚，物理和化学脱毒方法工艺设备要求高，增加了成本，同时对棉粕的营养价值也有不利影响。而微生物发酵降解游离棉酚具有以下优势:(1)生产成本低，不需要使用价格高昂的设备，不需加热或者添加化学试剂，无化学残留，应用安全［1］;(2)除了对棉粕中游离棉酚有去除作用，同时对其他的抗营养因子(如非淀粉多糖、单宁、植酸等)也有一定的去除作用;(3)增加棉粕中生物活菌数有利于动物肠道菌群的平衡帮助动物消化吸收，提高饲料利用率，同时发酵产生的酶可将大分子蛋白质降解为小分子蛋白质及小肽。对棉粕中游离棉酚微生物降解途径主要采用固态发酵，且大多需对棉粕底物进行灭菌处理［2－4］。然而，高温高压蒸煮灭菌本身会引起大部分棉酚由游离状态转变为结合状态［5］。因此，固态发酵棉粕降解游离棉酚一定程度上是高温高压的作用;另一方面，麸皮、玉米粉等辅料的添加会使游离棉酚含量相对下降。据报道，辅料添加、化学试剂和干燥过程中导致的棉酚含量直接和间接减少，真正微生物降解的棉酚含量要低于10%［6］。因此，对棉粕高温高压蒸煮处理后发酵降解游离棉酚存在高估单纯微生物菌株对游离棉酚的降解能力，且在实际生产中蒸煮无疑会增加处理成本和生产工艺繁琐程度，导致研究中所采用的发酵工艺很难做到规模化应用。因此，采用固态发酵生棉粕的途径降解游离棉酚受到重视［7－8］。从发酵类型看，生棉粕的固态好氧发酵和固态厌氧发酵两种类型都具有较好的去除游离棉酚的效果［7－10］，但固态厌氧发酵相对好氧发酵工艺简单，物料损耗小，更经济和便于实际应用，具有更好的发展前景。厌氧发酵生棉粕的菌种多为兼性厌氧型，如酵母菌［10］，而粪肠球菌还未见报道。但粪肠球菌是国家农业部允许使用的饲用微生物菌种，它属于革兰氏阳性球菌，无芽孢、无荚膜、生长代谢快，具有较好的黏附力，还可产生益生物质细菌素［11］。本实验室前期研究发现，粪肠球菌EF24 具有良好的棉酚去除效果。此研究采用粪肠球菌EF24 对生棉粕进行固态厌氧发酵，探索其去除游离棉酚的最佳发酵条件，以期为微生物发酵生棉粕提高饲用品质提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

菌种为本实验室筛选保藏的粪肠球菌EF24，棉粕购自新疆金鑫生物科技发展有限公司，水分含量11.37%，粗蛋白含量为47.25%，游离棉酚含量为638.60mg/kg。主要化学试剂有正己烷、异丙醇、3-氨基-1-丙醇、冰乙酸、苯胺，均为分析纯。培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。主要仪器设备为:SW-CJ-2D 型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司;41280型手提式压力蒸汽灭菌锅，上海华线医用核子仪器公司;HZQ-F160A 型高低温恒温振荡培养箱，上海一恒科学仪器有限公司;752 型紫外可见分光光度计，上海浦东物理光学仪器厂;DD-04 型高速中药粉碎机，温岭市大德中药机械有限公司。

1.2 实验方法

将斜面菌种接种于50 mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基上，37℃，120 r/min 培养24 h，活化菌种。然后取活化的菌液，以2%的接种量接到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃，120 r/min 培养24 h，制成发酵种子液。

固态厌氧发酵生棉粕:将粪肠球菌发酵种子液按2%接种量和1∶0.8 的料水比与1 000 g 棉籽粕基础发酵培养基混匀(自然pH 值)，然后平均分装到2 个8 号塑料袋，密封扎紧，37℃恒温静置培养5d。发酵结束，65℃烘干，粉碎，测定发酵样游离棉酚含量。游离棉酚含量测定采用国标苯胺法［12］，棉粕原样和发酵棉粕游离棉酚含量均换算成为绝干基础。

单因素试验:在上面固态厌氧发酵生棉粕的基础上，改变接种量、料水比、pH 值、发酵温度、发酵时间中的一个因素，固定其他4 个因素，进行单因素试验。分别选择发酵料水比、初始pH 值、发酵时间、接种量、发酵温度作为影响发酵棉粕游离棉酚含量的主要因素，通过单因素试验选取响应面试验的因素和水平。实验设计见表1。

表1 单因素试验设计Table 1 Single factor experiment design

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 料水比对棉粕游离棉酚含量的影响

由图1 可知当料水比为1∶0.6 时发酵棉粕中游离棉酚含量最低，即游离棉酚降解率最大。随着料水比比值增大，发酵底物水分含量升高，发酵棉粕中游离棉酚含量出现缓慢上升趋势。底物适宜水分含量的重要性以及水分对生物合成和棉酚脱毒的影响归因于它影响固体颗粒的物理特性。水分含量高虽然减少底物的通透性，限制了氧气的传递［13－15］，有利于厌氧发酵，但对该菌降解游离棉酚而言，水分含量过高则是不利的，结果表明在料水比1∶0.6 有利于该菌对游离棉酚的降解。可能在此条件下更加适合游离棉酚降解酶的产生，确切的机理有待进一步研究。底物水分含量过低会引起底物营养物溶解性的减少以及底物颗粒的膨胀程度降低，从而影响发酵脱毒［16］。

图1 料水比对棉粕游离棉酚含量的影响Fig.1 Effect of ratio of material to water on the content of free gossypol in cottonseed meal

2.1.2 初始pH 值对棉粕游离棉酚含量的影响

如图2 所示，当初始pH 为6.5 时游离棉酚含量最低，及棉粕游离棉酚降解效果最好。可能在此最适pH 值下游离棉酚与微生物分泌的氨基酸，或者活性蛋白质中游离氨基结合，形成结合棉酚［17］或者微生物分泌的可降解棉酚的酶类，分解利用游离棉酚，从而使棉酚含量降低［18］。

图2 初始pH 值对棉粕游离棉酚含量的影响Fig.2 Effect of initial pH on the content of free gossypol in cottonseed meal

2.1.3 发酵时间对棉粕游离棉酚含量的影响

如图3 所示，发酵3d 时，棉粕游离棉酚含量最低，游离棉酚降解效果最好，随着发酵时间延长，游离棉酚含量出现上升趋势。这可能是由于微生物与发酵后培养基中其他化合物的相互作用，引起棉酚降解酶的变性或分解，还有部分结合棉酚转化成游离棉酚［19］。

图3 发酵时间对棉粕游离棉酚含量的影响Fig.3 Effect of fermentation time on the content of free gossypol in cottonseed meal

2.1.4 接种量对棉粕游离棉酚含量的影响

试验结果(见图4)表明，当菌液接种量为4%时，发酵棉粕游离棉酚含量最低，游离棉酚降解率最高。大于4%接种量的底物反而使棉酚的降解率下降，这可能是由于高接种量可能引起微生物生长过度，从而导致棉酚降解酶分泌的抑制［20］。

图4 接种量对棉粕游离棉酚含量的影响Fig.4 Effect of inoculation amount on the content of free gossypol in cottonseed meal

2.1.5 发酵温度对棉粕游离棉酚含量的影响

发酵温度的高低在发酵工艺中非常重要。在发酵初期，由于微生物生长代谢能力强，温度升高很快，而固态发酵传热率差，物料温度会在短时间内急剧升高［21］。如果散热不畅，将会导致热量积聚，减少了微生物的活动，从而影响游离棉酚降解效果。如图5 所示，发酵温度为37℃时，发酵棉粕游离棉酚含量最低，游离棉酚降解率最高。

2.2 响应面优化

图5 发酵温度对棉粕游离棉酚含量的影响Fig.5 Effect of fermentation temperature on the content of free gossypol in cottonseed meal

响应面试验设计［22］采用SAS9.1 软件，根据Box-Behnken 的中心组合试验设计原理，选择单因素试验中对响应值Y(游离棉酚含量)有显著影响的因素作为自变量，采用3 因素3 水平的Box-Behnken 响应面试验设计法。以料水比、初始pH 值、发酵时间为自变量，分别以x1、x2、x3表示，并以+1、0、－1 分别代表自变量的高、中、低水平，按方程Xi=(xi－x0)/x对自变量进行编码，其中Xi为自变量的编码值;xi为自变量的真实值;x0为试验中心点处自变量的真实值;x为自变量的变化步长。试验因素及水平见表2，试验设计与试验结果见表3。

表2 响应面设计试验因素与水平Table 2 Factors and levels in response surface design

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Response surface design and corresponding results

2.2.1 方差分析

对表3 中游离棉酚含量的试验数据进行多元回归分析，分析结果见表4。从表4 可以看出，方程的决定系数为95.89%，表明用上述回归方程描述各因素与响应值之间的关系时，其因变量和全体自变量之间的线性关系显著，该模型与实际实验拟合较好。从表4 可以看出，以游离棉酚含量为响应值所建立的回归模型是较显著的。方程一次项、二次项的影响显著，表明各影响因素对游离棉酚含量都不是简单的线性关系。由表4 中P值可知，各因素影响程度从大到小的依次排列为料水比、初始pH 和发酵时间。

表4 回归模型的方差分析Table 4 Analysis of variance for the fitted regression model equation

2.2.2 响应曲面分析

由图6 ～图8 可知，响应值随着3 因素的上升而显著增大，各因素值过高，响应值又呈下降趋势;初始pH 值与发酵时间交互作用较显著，料水比与初始pH值、料水比与发酵时间交互作用较小，近似圆形，与表4 中交互项P值的分析结果一致。

为了确定各因素的最优值，将所得回归方程分别对各自变量取一阶偏导等于零可得一个三元一次方程组:

39.242 5 +55.168 34X1+7.522 5X2+14.417 5X3=0

－12.558 75 +7.522 5X1+120.733 34X2+29.065X3=0

4.911 25 +14.417 5X1+29.065X2+31.513 34X3=0

图6 游离棉酚含量与初始pH 值、发酵时间的响应面图及其等高线Fig.6 Response surface contour plots showing effect of initial pH and fermentation time on the content of free gossypol

图7 游离棉酚含量与料水比、发酵时间的响应面图及其等高线Fig.7 Response surface contour plots showing effect of ratio of material to water and fermentation time on the content of free gossypol

图8 游离棉酚含量与料水比、初始pH 值的响应面图及其等高线Fig.8 Response surface contour plots showing effect of ratio of material to water and initial pH on the content of free gossypol

求解方程组，可得模型极值坐标为:X1= －0.745 48，X2=0.136 10，X3=0.059 69，即当料水比为1:0.53，初始pH 值为6.57，发酵时间为3.06d 时游离棉酚含量最低为221.48 mg/kg。

2.2.3 回归模型的验证实验

为了检验模型预测的准确性，在最佳发酵条件(料水比1∶0.53，初始pH 值6.57，发酵3.06 d，接种量4%，37℃)下进行4 次平行试验，发酵棉粕游离棉酚含量分别为229.69 mg/kg，230.22 mg/kg，231.19 mg/kg，235.63 mg/kg，即平均游离棉酚含量为231.68 mg/kg 实验值与理论值很接近，因此，该模型可用于预测固态发酵棉粕中游离棉酚降解情况。

3 结论

在料水比1∶0.53，初始pH 值6.57，发酵3.06 d，接种量4%，37℃的条件下，利用粪肠球菌EF24 厌氧固态发酵未经灭菌的生棉籽粕，其游离棉酚可从720.52 mg/kg 降至250 mg/kg，达到小于300 mg/kg的低酚棉籽粕的标准［23］。此方法工艺简单，不失为一种经济有效的降低棉粕含量的微生物发酵方法。

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