张引成，尹晓婷，雷云，韦莹莹，潘磊庆，屠康

(南京农业大学食品科技学院，江苏 南京，210095)

单核细胞增生性李斯特菌属于李斯特菌属，可在极端的环境中生长和存活，耐高盐环境，能忍受冷冻和干燥［1］，能在冷藏温度下繁殖的致病菌，对低温有较强的耐受性，(4 ±2)℃条件下仍能生长繁殖，－20℃低温下可部分存活，对热的抵抗力较弱，60 ℃、30 min 可灭活。近几年我国检疫人员对国内不同地区的各类食品进行了抽样检测，其中生鲜蔬菜中单增李斯特菌检出率高达16%［2－5］。

结球莴苣是蔬菜沙拉中最主要的一种配菜，常单独或同其他蔬菜在一起包装，即开即食，在过去的10年中，其市场份额占鲜切蔬菜产品总量的80%［6］。然而，蔬菜组织由于被切割后汁液外渗，很容易感染单增李斯特菌，从而引发食源性疾病，增加了食品安全风险。预测食品微生物学(predictive food microbiology)作为保证食品微生物安全方面的基础研究，旨在以计算机为基础，描述特定环境下各种微生物的行为，借此数量化预测细菌的生长、残存、死亡情况。预测微生物学的研究模式包括3 个层次:初级、二级、三级，其具体表现为:微生物生长过程与时间的关系、考虑了环境因素之后的微生物生长模型、计算机软件程序或称专家系统的建立［7］。为探讨该菌在鲜切结球莴苣贮藏期间的消长规律，本文主要研究在4、8、16、24、32 ℃5 个不同贮藏温度下，鲜切结球莴苣中单增李斯特菌数量的动态变化，采用DPS (data processing system)统计分析软件，建立了相应的初级和次级函数模型。

1 材料与方法

1.1 材料和设备

结球莴苣，购买于南京紫金山附近菜园，为了充分去除田间热，莴苣经采收后迅速进行预冷处理。挑选颜色翠绿且完整、无病虫害和机械损伤的叶片，清洗干净后通风处晾干，用锋利不锈钢刀切割出10 g 叶片，紫外线下正反面各灭菌20 min 后保存于培养皿中。

单增李斯特菌(CICC 21662)，中国工业微生物菌种保藏管理中心;PALCAM 琼脂，北京陆桥技术有限责任公司;高压蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司;生化培养箱，南京贝帝实验有限公司;酸度计，上海精密科学仪器有限公司;电子天平，上海奥豪斯有限公司;移液器，北京青云卓立精密设备有限公司;生物安全柜，上海新苗医疗器械制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 接种液的制备

菌种活化后，将单增李斯特菌菌液，用划线法接种于胰酪胨大豆酵母肉汤琼脂(TSA-YE)平板上进行培养，37 ℃下培养24 h，观察培养结果，然后挑取典型菌落接种入TSB-YE 培养液中，37℃下培养18 h，此时菌液浓度约为108CFU/mL 左右，用灭菌的生理盐水适当稀释，使菌液浓度为103CFU/mL，即得接种液。

1.2.2 单增李斯特菌的接种

用移液器取0.1 mL 单增李斯特菌接种液至10 g经过灭菌的结球莴苣页面表面，分别置于4、8、16、24、32 ℃恒温生化培养箱中培养，每隔一段时间，取出样品，放入90 mL 无菌生理盐水中，充分震荡摇匀，用移液器取出0.1 mL 稀释液至PALCAM 琼脂上，进行涂布，涂布后的PALCAM 琼脂平板倒置于37℃恒温培养箱培养24 h 后，进行菌落计数。

1.3 数学模型的建立与验证

1.3.1 初级预测模型的建立

首先对单增李斯特菌的生长曲线进行拟合，按照Zwietering 等［8］人修正的Gompertz 模型，估计生长曲线的最大比生长速率(growth rate，μmax)和迟滞时间(lag time，λ)。

式中:t，时间(h);λ，迟滞时间(h);Nt，t时的菌数(CFU/mL);N0，初始菌数(CFU/mL);Nmax，最大菌数(CFU/mL);μmax，最大比生长速率(h－1)。

应用Excel 2003 统计所有数据，应用SAS8.2 统计分析软件进行方差分析(ANOVA)和显著性检验，对SigmaPlot 10.0 中Gompertz-four factors 模型稍作修改，对上述的Gompertz 方程进行拟合，并绘图，建立初级生长模型。

1.3.2 二级预测模型的建立

温度对单增李斯特菌生长动力学的影响可以建立二级模型进行研究，由Bělehrádek 开创［9］、Ratkowsky［10］等改进的平方根模型可以简单有效地描述温度与微生物生长参数之间的关系:

式中:μmax，生长速率(h－1);λ，迟滞时间(h);T，温度(℃);bmax、bλ，待估回归系数;Tmin，是通过外推回归线与温度轴相交而得到的温度，是一个假设温度，指的是在此温度条件下微生物没有代谢活动。

将(1)中得到的生长速率μmax和其所对应的温度分别代入(2)(3)2 个方程式，得出bmax、bλ、Tminμ和Tminλ值。将所得参数值代回原等式，即可得到温度对于最大比生长速率的影响。

1.3.3 模型的可靠性评价

根据Ross［11］与Mellefont［12］等提出的准确因子(accuracy factor，Af)和偏差因子(bias factor，Bf)来评价已经建立的单增李斯特菌生长动力学预测模型的可靠性。准确因子和偏差因子用下式表示:

式中:pred，预测值;obs 为，实测值;n，试验次数。

(1)当Bf＜0.70 或Bf＞1.15，此时模型不可靠，不能用于模拟描述微生物生长等状况;

(2)当0.70 ＜Bf＜0.90 及1.06 ＜Bf＜1.15 之间时，模型的精确度可以接受，但误差较大;

(3)当0.90 ＜Bf＜1.05 之间时，模型准确因子高，误差小。

但系统偏差(systematic deviation)不能由Af和Bf描述，而可用预测值和观察值的残差分析［13］来揭示，所建立的预测模型的残差值越小，表明模型的准确性越高。因此，本文选用准确因子(Af)、偏差因子(Bf)和残差分析对所建立的数学模型进行检验。

2 结果与分析

2.1 初级预测模型的建立

根据4、8、16、24、32 ℃单增李斯特菌在鲜切接球莴苣上生长试验观察值，选用修正的Gompertz 方程回归描述单增李斯特菌的生长动态。试验观察值和拟合曲线如下:

根据拟合曲线，鲜切结球莴苣中单增李斯特菌在不同温度下的生长，用修正的Gompertz 模型回归得到的方程如下，表1 为其具体的生长动力学参数:

表1 不同温度下单增李斯特菌在鲜切结球莴苣中的生长动力学参数Table 1 The parameters growth rate(μmax)and lag time(λ)of L. monocytogenes obtained from Gompertz function

logN(t)=3.115 +1.787 ×Exp{－Exp［0.086 ×(99.773 －t)+1］} 4℃

logN(t)=3.120 +1.997 ×Exp{－Exp［0.052 ×(55.511 －t)+1］} 8℃

logN(t)=3.172 +3.148 ×Exp{－Exp［0.069 ×(12.458 －t)+1］} 16℃

logN(t)=3.188 +3.546 ×Exp{－Exp［0.134 ×(4.592 －t)+1］} 24℃

logN(t)=3.019 +4.391 ×Exp{－Exp［0.213 ×(3.325 －t)+1］} 32℃

图1 不同温度下单增李斯特菌在鲜切结球莴苣中的生长拟合曲线Fig.1 Curve of L. monocytogenes grown on fresh-cut iceberg lettuce at different temperatures

2.2 二级预测模型的建立

由图2 可以看出，温度与(μmax)0.5和(1/Lag)0.5呈现较好的线性关系，2 种模型中的R2分别为0.977 2和0.984 7，温度与Lag、μmax 的平方根方程为:

2.3 模型的可靠性评价

分别在4、8、16、24、32℃下，在8 个随机时间点(单位:h)进行模型的验证实验，测定该时间点的菌数值，并将实验测定的值与该点模型的预测值比较，进行残差分析和准确因子及偏差因子分析。

不同温度下几个随机点的实测值和预测值见表2。

图2 单增李斯特菌在鲜切结球莴苣中的二级模型生长曲线:(A)μmax1/2 －T;(B)(1/lag)1/2 －TFig.2 Secondary model of L. monocytogenes grown on fresh-cut iceberg lettuce

表2 李斯特菌在不同温度下拟合Gompertz 模型的几个随机点的实测值和预测值Table 2 The observations and predictions of L. monocytogenes at different temperatures

2.3.1 残差分析

为了验证预测值与实验值的差异性，进行了残差分析实验，实验结果见图3。由4、8、16、24、32℃下残差分析图，可直观地看出，每个温度下预测值与实验值之差均在±0.1 之间，说明所建立的预测模型在α=0.1 的水平上是可信的。

2.3.2 准确因子和偏差因子验证

本试验的研究结果表明，各组偏差因子Bf值都在0.90 ～1.0，由1.3.3 中可靠性评价方法知，本试验的模型属于最好类型。

图3 不同温度下预测值与实测值的残差分析图Fig.3 The residuals of L. monocytogenes grown at different temperatures

在进行数学检验［14］的时候，由于偏差因子不能表示参数估计的平均准确性(average accuracy of estimates)，因此常结合准确因子(Af)来进行分析，Af值越大表示平均值准确性越低，而Af值等于1 表示预测值与观测值之间完全吻合(perfect consistency)［15］。

如表3 所示，预测值的上下波动幅度和误差均较小(＜1.80)［16］，说明所建立的生长预测模型能很好地预测单增李斯特菌在4 ～32℃下的生长状况。

表3 在4、8、16、24、32℃下L.M 在鲜切结球莴苣中生长预测值的偏差因子和准确因子Table 3 Mathematical validations of secondary model of L. monocytogenes grown on fresh-cut iceberg lettuce

3 结论

本文用修正的Gompertz 方程拟合了不同温度下单增李斯特菌在鲜切结球莴苣上的生长情况，温度对μmax和λ 的影响，采用次级平方根模型进行描述，以下为基于鲜切结球莴苣二级模型:

二级模型为线性方程，方程的R2为0.977 2 和0.984 7，呈现良好的线性关系。由此可知，所建立的预测模型能很好地描述不同温度下单增李斯特菌的生长动态。本研究通过向鲜切蔬菜上接种单增李斯特菌来获得生长数据从而建立模型，这种方法虽然操作烦琐，但将食品原料组织对特定微生物生长的影响考虑在建模范围内，所建立的模型能较好地预测特定微生物在食品上的实际生长情况。

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