涂建飞，刘一之，纪建松

自从Zubkov等于2000年首先报道1例因脑血管痉挛死亡患者的基底动脉内膜存在内皮细胞凋亡的事实后，人们开始关注血管内皮细胞（VEC）凋亡在痉挛中的临床作用。而早期脑损伤概念［1-3］的提出，更是引发了VEC凋亡的研究热潮。研究发现，早期脑损伤可能通过细胞凋亡、炎症反应、缺血机制，最终导致细胞死亡，进而导致血脑屏障破坏、胞水肿，以至于神经元坏死。而早期脑损伤是死亡的重要原因，也是迟发性功能障碍的重要因素。因此，干预VEC凋亡成为治疗脑血管痉挛的新靶点。然而，对于VEC凋亡的发生时间、意义则缺乏相关的研究，本文拟通过电镜及免疫组化观察VEC凋亡在脑血管痉挛中不同时间点的表达，为临床治疗提供理论依据并开拓新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组

35只4～5月龄健康清洁级新西兰大白兔由苏州大学医学院实验动物中心提供，体重2.5～3.5 kg，随机分为 12 h、1、2、3、7 d 组，每组 7 只。 每组又分为蛛网膜下腔出血（SAH）亚组5只及对照亚组2只 （即导丝仅进入但未刺破颈内动脉）。出现死亡则给予补充。

1.2 动物模型的制备

采用血管内穿刺法制作兔SAH模型。用30%乌来糖（2.0～3.0 ml/kg）溶液静脉注射麻醉成功后，采用外科方法通过兔股动脉引入0.035英寸超滑导丝和4 F H1导管，将导管插到右侧颈总动脉中上段，常规行右颈总动脉造影，了解颈内动脉起始段血管走行。随后引入塑形的EXCEL-14微导管（Boston 公司）和 Transend 微导丝（Cordis公司），在路图状态下将导管插到颈内动脉。然后引入微导丝硬头到颈内动脉，快速将导丝推出导管约1 cm，重复1～2次后，退出导丝。最后撤离导管，右股动脉结扎，皮肤缝合。

1.3 透射电镜及免疫组化观察

1.3.1 透射电镜观察 12只实验兔 （SAH亚组10只，对照组2只）分离出右颈内动脉，将血管迅速放入预冷的2.5%戊二醛溶液固定。常规丙酮梯度脱水，618环氧树脂包埋，行超薄切片后透射电镜观察、摄片。

1.3.2 免疫组化观察 三磷酸脱氧尿嘧啶缺口末端标记法 （TUNEL）操作按检测试剂盒 （美国Biovision公司）说明书进行。在显微镜下观察拍照。凋亡细胞的判定：细胞核固缩、致密、黄色或棕色改变；未凋亡细胞核呈蓝色改变。每张玻片在显微镜高倍视野下观察基底动脉 （BA）及后交通动脉（PCoA）的内皮细胞，计数TUNEL阳性细胞及正常内皮细胞，用百分数表示，统计凋亡率。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 动物行为学观察

各SAH亚组动物术后第1天表现为嗜睡，活动差，厌食，以术后12～18 h最重。其中1只实验兔昏睡2 d。大多数动物1 d后精神状态逐渐好转。7 d时同正常组无明显不同。

2.2 血管痉挛的形态学结果

在各观察时间点内，所有SAH亚组动物PCoA及BA均出现管腔内直径缩小，12 h组最明显，随后在第7天再次明显收缩。而血管壁厚度的增加，则以7 d组最明显（表1）。

2.3 电镜表现

SAH亚组血管内皮间紧密连接消失，部分内皮细胞核固缩，空泡化，弹力膜扭曲。平滑肌细胞胞质内线粒体肿胀，空泡化，粗面内质网扩张，部份细胞出现核边集，核固缩（图1）。PCoA内皮细胞凋亡动态变化见图2。

表1 动物脑血管动态改变（ ± s）

表1 动物脑血管动态改变（ ± s）

注：PCoA=后交通动脉，BA=基底动脉

参数 对照组 12 h组 1 d组 2 d组 3 d组 7 d组PCoA直径 196.81±10.16 110.88±13.30 159.88±11.61 151.89±16.10 139.98±20.67 139.09±8.56 PCoA管壁 28.45±6.71 32.96±4.24 32.45±7.01 35.18±7.97 34.94±3.71 44.65±8.33 BA直径 428.72±24.37 206.58±23.32 333.06±23.02 293.40±10.96 338.97±19.37 234.97±16.56 BA管壁 43.39±3.89 51.36±12.35 52.82±7.13 52.04±7.21 50.95±8.31 62.62±5.70

2.4 内皮细胞凋亡表现

PCoA 内皮细胞凋亡率（%）在对照组、12 h、1、2、3、7 d组 凋 亡率 分 别 为 0.01 ± 0.02、0.06 ±0.06、0.26 ± 0.20、0.31 ± 0.12、0.39 ± 0.16、0.29 ±0.07。对照组内皮细胞核呈蓝色，未见TUNEL阳性细胞。SAH亚组中，12 h组和7 d组偶见TUNEL阳性细胞 （图3、4），1 d组内皮细胞出现TUNEL阳性细胞，在3 d组达到高峰。7 d组较前有所下降。对照组与1、2、3、7 d组比较差异有统计学意义 （P<0.02）；2 d组和3 d组分别与12 h组和1 d组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。本组平滑肌细胞可见TUNEL阳性细胞，与电镜表现相符。由于多张切片未找到BA血管断面，未对BA行统计学分析。

图1 SAH后2 d，内皮细胞核边集，凋亡样改变

图2 内皮细胞凋亡时间曲线图

3 讨论

细胞凋亡是调节机体生长、发育及维持机体细胞平衡的重要生理机制。然而，当其调节紊乱，则会导致疾病的发生。近期研究表明，脑血管疾病特别是缺血性脑血管疾病（包括狭窄与痉挛）的病理损伤程度与细胞凋亡密切相关。SAH后痉挛血管壁内皮细胞存在凋亡现象，在脑血管痉挛形成机制中起重要作用［4-6］。本研究拟重点观察细胞凋亡的时间窗及意义，为今后深入研究凋亡的价值作一铺垫。

本实验发现SAH后12 h VEC凋亡不明显，在第1天少量出现，在2～3 d明显增加，3 d组达到峰值，7 d组明显下降。两种观察法均支持此点。对于凋亡的出现时间与叶伟等［7］和 Cahill等［8］的研究基本相符，实验均证实VEC凋亡出现的时间可能在SAH后24 h，细胞凋亡进一步造成血脑屏障的完整性受到影响，导致脑水肿及细胞坏死，可能是加重早期脑损害的主要原因。

图3 SAH后12 h BA内皮细胞无凋亡，部分内皮细胞脱落（HE，× 40）

图4 SAH后2 d PCoA内皮细胞凋亡(HE，×100)

对于细胞凋亡的持续时间，Cahill等［8］采用大鼠穿刺模型研究24、72 h的血管凋亡情况，虽然血管痉挛持续72 h，但是发现凋亡在24 h明显升高，72 h下降。史焕昌等［9］采用兔注血模型在SAH后72 h检查发现VEC凋亡。游鸿海等［10］在二次注血的兔模型上发现，细胞凋亡和Cyt-C表达均在SAH后增多，于第7天达高峰，第10天逐渐下降。Zubkov等对二次注血的狗模型行血管造影发现，SAH后3 d开始出现血管痉挛，7 d达高峰。通过形态学检查发现，3 d在痉挛血管内皮出现凋亡样细胞，凋亡程度随时间加重。这种凋亡时间上的改变，目前认为氧合血红蛋白是细胞凋亡的主要诱因。血块中分解出代谢产物（如氧合血红蛋白）需要一定的时间，而氧合血红蛋白一般在2 d内从外膜穿过血管壁并停留在内皮，故本实验VEC凋亡高峰出现时间迟，在2～3 d达到高峰。至于细胞凋亡高峰时间不同的原因可能是：①动物种类的差别。选用不同种属的动物，可能出现不同的观察结果。②制作方法不同。注血法是由于脑池内血块分解出代谢产物，凋亡诱因再作用于血管内皮需要一段时间，因而可能表现为凋亡时间延迟。而我们采用血管内穿刺法，细胞因子和血管剪切力等因素均在早期作用于内皮，可能使细胞凋亡峰值提早。我们认为二次注血模型虽然在痉挛时间上模拟了人的痉挛时间，但二次注血的凋亡诱因多次作用于内皮，可能不能准确模拟VEC凋亡的时间窗。

通过本组实验，我们认为早期的少量细胞凋亡可能是细胞因子等因素直接作用于内皮所致，而后期的大量凋亡则是氧合血红蛋白作用的结果。在后期，氧合血红蛋白浓度下降，导致VEC凋亡减少，这可部分解释本实验中7 d组VEC凋亡减少的原因。

本实验亦发现血管壁的平滑肌细胞和成纤维细均出现凋亡改变。细胞凋亡以SAH后1、2 d明显，凋亡峰值时间早于脑血管痉挛，表明凋亡诱因作用于血管壁全程，本实验中，3、7 d组出现胶原增多，平滑肌细胞和成纤维细胞增生可能与此有关。Park等的实验结果表明，SAH后脑血管痉挛过程中确实有细胞凋亡的发生，细胞凋亡的程度以受累VEC为最重，其次是某些下丘脑神经元细胞，大脑皮层受累最轻，表明细胞凋亡在脑血管痉挛的后期亦是重要因素，主要是在迟发性痉挛的早期阶段发挥作用，主要通过刺激细胞增生、损伤神经元细胞等方式参与。

细胞凋亡的途径主要有两条［11］，一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase，另一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase。这些caspase的活化可将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡。有文献报道，通过细胞凋亡的通路抑制细胞凋亡，虽然不能预防脑血管痉挛，但能改善临床症状，减轻早期脑损害，上述研究为治疗和预防脑血管痉挛阐释增加了新的思路［12-15］。

本实验中，BA多支血管断面未找到内皮细胞，主要是VEC在受到刺激后容易脱落，其次是TUNEL法的固有缺限，在以后的研究中，可考虑辅以Western印迹技术检测ADP核糖多聚合酶（PARP）判断VEC凋亡，从而提高判断凋亡的准确性。

综上所述，本研究在兔脑血管穿刺模型上证实VEC出现凋亡现象，凋亡主要出现在SAH后24 h，本组在3 d达峰，略早于迟发性痉挛的峰期，表明VEC凋亡在脑血管痉挛中起重要作用。

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