刘家宏 ，徐小洁 ，符静 ，范忠义 ，吕朝晖 ，陆菊明 ，肖文华 ，叶棋浓 ，朱建华

1.解放军总医院 a.第一附属医院肿瘤科，北京 100037；b.内分泌科，北京 100853；

2.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850

随着老龄化社会的加速及生存环境、生活方式的改变，恶性肿瘤发病率和死亡率逐渐升高，成为威胁人类生命健康的重要因素。肿瘤抑制因子p53是迄今发现的与肿瘤发生、发展关系最为密切的抑癌基因[1]。研究表明[2]，50%以上的恶性肿瘤病人发生了p53基因突变。由于点突变、基因片段缺失和p53蛋白失活等导致的p53功能缺陷，可通过多种分子机制引起细胞过度增殖和遗传物质的改变，逃避机体对癌变细胞的免疫监控作用,最终导致肿瘤的发生[3]。p53与机体免疫系统的功能和免疫反应关系密切，表现在：一方面，p53，尤其是突变型p53可以作为肿瘤相关抗原激发机体免疫反应；另一方面，p53可以直接启动免疫细胞中一些基因的表达，从而对这些细胞的增殖和功能发挥调节作用，以达到杀伤肿瘤细胞的目的[4]。因此，寻求增加内源性p53蛋白的表达，可以成为治疗肿瘤的一个突破点。

基因表达可以在不同水平上进行调控，其中转录水平的调控是调控表达的关键环节。转录因子是广泛存在于机体各种组织、细胞中能够结合靶序列的蛋白质，这些蛋白质能够调控特定基因的转录，在肿瘤的发生、发展和浸润、转移中起重要作用。为了研究p53在转录水平上的调控，筛选出新的调控p53的转录因子，我们从人HepG2细胞基因组中扩增出p53基因约3 kb的启动子，将其克隆至萤光素酶报告基因载体pGL4.0-empty中，为研究p53的转录调控和寻找治疗肿瘤的新靶点奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

SV40病毒转化的人胚胎肾293T细胞、乳腺癌ZR75-1细胞、肝癌HepG2细胞、肺癌A549细胞由本室传代培养；pGL4.0-empty载体及萤光素酶底物购自Promega公司；限制性内切酶、DNA连接酶、Prim⁃erStar酶购自TaKaRa公司；DNA纯化试剂盒购自申能博彩公司；DMEM培养基及小牛血清均购自Gibco公司；Vigofect转染试剂购自Vigorous公司。引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成，测序由北京奥科生物技术有限责任公司完成。

1.2 人p53启动子片段的扩增

以人肝癌细胞HepG2的基因组为模板，在NCBI网站搜索并合成p53启动子序列。上游引物为5'-GGGGTACCAGCCTTCACATGACTGATCCCTTAT CCTC-3'，下游引物为5'-CCGCTCGAGGAAAACCC CAATCCCATCAACCCCT-3'。上下游引物5'端分别携带KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点。PCR反应条件：95℃ 5 min；94℃ 1 min，62℃ 30 s，72℃ 3 min，30个循环；72℃ 7 min。

1.3 重组质粒的构建与测序

在37℃下，用KpnⅠ/XhoⅠ双酶切pGL4.0-empty载体4 h，经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收载体大片段；将PCR产物回收后再用KpnⅠ/XhoⅠ双酶切，用T4DNA连接酶连接入pGL4.0-empty载体。转化大肠杆菌DH5α，挑选克隆，振荡培养并提质粒，KpnⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定，将酶切鉴定正确的克隆送北京奥科生物公司测序。

1.4 哺乳动物细胞的培养及转染

按常规方法进行转染[5]，用不含双抗、含10%胎牛血清的DMEM培养基将人胚肾293T细胞接种于24孔板中，接种量以转染时细胞密度达到80%为宜，培养24 h后进行转染。将总量为1.0 μg的质粒与25 μL 生理盐水混合，再将 0.5 μL Vigofect与 25 μL生理盐水混合，然后将上述2种溶液轻轻混合，室温放置15 min，加入24孔板中，37℃、50 mL/L CO2条件下培养。

1.5 萤光素酶和β-半乳糖苷酶活性测定

萤光素酶活性测定基本按Promega公司的试剂盒说明书进行。转染细胞后，吸掉培养基，用PBS洗1次，加入100 μL裂解缓冲液，室温轻摇15 min，刮下细胞，收集到1.5 mL的离心管中，振荡5 min，4℃、12 000 r/min离心3 min，收集上清液，用荧光剂测量荧光值。

用ONPG测定β-半乳糖苷酶活性。将30 μL上述上清液与100 μL预先以9∶2混匀的Z缓冲液/β-巯基乙醇∶ONPG溶液混合，37℃温育，直到出现浅黄色为止；加入250 μL浓度为1 mol/L的Na2CO3终止颜色反应,测定样品的D420nm值。取荧光值平均值与对应的β-半乳糖苷酶活性值相除，将未加重组质粒的数值归一，与此相比所得倍数为最终结果。

2 结果

2.1 人p53启动子的PCR扩增

以人肝癌细胞系HepG2细胞的基因组为模板，PCR扩增p53的启动子序列，PCR产物约3000 bp，与预期片段大小一致（图1）。

2.2 p53启动子报告基因的构建与鉴定

用KpnⅠ/XhoⅠ双酶切PCR产物后，克隆到经同样双酶切的pGL4.0-empty载体中，转化大肠杆菌DH5α，挑选的阳性克隆提质粒经酶切鉴定，得到与预期长度一致的插入片段,而空载体酶切只见一条载体带（图2），表明p53启动子已插入pGL4.0-empty上游的多克隆位点中。测序结果证实与已知序列一致（数据略）。

2.3 293T细胞中p53启动子活性的测定

图1 目的基因的PCR扩增

图2 重组质粒的酶切鉴定

在293T细胞中，分别转染pGL4.0-empty和不同浓度梯度的pGL4.0-pp53，萤光素酶活性测定结果见图3。与空载体相比，转染重组质粒后萤光素酶活性明显提高，且萤光素酶活性随转染剂量的升高逐渐增高，说明pGL4.0-pp53在293T细胞中具有转录活性，且转录活性呈现一定的剂量效应。

2.4 ZR75-1、HepG2、A549细胞中p53启动子活性的测定

为了验证p53启动子的活性是细胞特异性还是在多种细胞中有广泛效应，将pGL4.0-pp53重组质粒分别转染人乳腺癌ZR75-1细胞、肝癌HepG2细胞及肺癌A549细胞，24 h后收集细胞测定萤光素酶活性。结果见图4，与空载体相比，转染重组质粒后ZR75-1、HepG2、A549细胞中的萤光素酶活性提高了几倍至数十倍，表现了重组质粒中的p53启动子活性，说明p53启动子在多种细胞中具有转录活性。

2.5 转录因子USF对p53报告基因转录的影响

转录因子USF是一种已知的能升高p53转录水平的转录因子[6]，我们通过检测转录因子USF对p53启动子转录活性的影响，验证了pGL4.0-pp53的活性及功能，结果见图5。在293T细胞中，将不同剂量的USF和pGL4.0-pp53共转，萤光素酶活性检测结果显示，随着转录因子USF剂量的增加，p53启动子的转录活性也逐步增加，说明USF对p53的活性调节呈剂量依赖效应，也进一步表明我们所构建的pGL4.0-pp53具有与文献报道一致的活性及功能。

3 讨论

恶性肿瘤是严重威胁人类生命的重要疾病之一，目前全球约有1000万人患有恶性肿瘤，每年有800余万人死于恶性肿瘤，而且这一数字呈不断增长的趋势。由于p53能有效抑制肿瘤细胞增殖，并能参与机体细胞、体液免疫应答，诱导凋亡，因此p53表达的精细调节显得尤为重要。基因表达是遗传信息的转录和翻译过程，可以在不同水平上进行调控，其中转录水平的调控是调控表达的关键环节。转录水平的调控主要依靠转录因子的调节，转录因子之所以能诱导基因转录，主要是与目的基因的启动子相互作用。Damell等[7]也认为，选择转录因子作为抗肿瘤靶点是合理的。野生型p53蛋白的活性形式为四聚体，自N端起依次为转录活化区、DNA结合区、四聚体化区和C端调节区，其启动子区域不含TATA盒，也没有富含GC区域，而后两者均为促进转录开始的重要应答元件。虽然它在互补链-80位上含有CAAT盒，但是否有转录因子与之结合目前还不甚清楚。p53的转录调节是一个复杂的过程,其中包括许多已证实和未证实的转录调节因子。对p53转录因子的筛选，可能有助于发现新的肿瘤治疗的靶标。因此，我们构建的p53启动子调控的萤光素酶报告基因将在p53转录调节的研究及筛选新的调控p53的转录因子中发挥重要作用。

转录因子USF是一种细胞编码的转录因子，能够调节某些病毒及基因的转录。该因子以位点特异性方式结合CACGTG[8]，在腺病毒中使腺病毒后期启动子转录活性增加3～25倍。USF通过靠近蛋白N端的2个转录激活区域激活靶基因转录活性，而起始蛋白TFⅡ-Ⅰ也参与这一过程。活性测定结果显示，转录因子USF能明显增高p53的活性，与文献报道相符，证明我们所构建的p53启动子的萤光素酶报告基因是可靠并具有活性的。

另外，本实验构建的p53启动子调控的萤光素酶报告基因序列已知，且是天然存在的。萤光素酶报告基因系统操作简便，检测灵敏，可以一次筛选多个转录因子，这为发现新的p53转录因子奠定了扎实的实验基础。

图3 不同剂量p53启动子活性的测定

图4 不同细胞中p53启动子活性的测定

图5 不同剂量USF对p53启动子报告基因的影响

[1]Levine A J,Momand J,Finlay C A.The p53 tumour suppres⁃sor gene[J].Nature,1991,351(6326):453-456.

[2]Royds J A,Iacopetta B.p53 and disease:when the guardian angel fails[J].Cell Death Differ,2006,13(6):1017-1026.

[3]Bargonetti J,Manfredi J J.Multiple roles of the tumor sup⁃pressor p53[J].Curr Opin Oncol,2002,14(1):86-91.

[4]贾晓.p53与抗肿瘤免疫[J].细胞与分子免疫学杂志,2008,12:1214-1215.

[5]Datta R,Rubin E,Sukhatme V,et al.Ionizing radiation acti⁃vates transcription of the EGR1 gene via CArG elements[J].Proc Natl Acad Sci USA,1992,89(21):10149-10153.

[6]Pognonec P,Roeder R G.Recombinant 43-kDa USF binds to DNA and activates transcription in a manner indistinguish⁃able from that of natural 43/44-kDa USF[J].Mol Cell Biol,1991,11(10):5125-5136.

[7]Damell J E Jr.Transcription factors as targets for cancer ther⁃apy[J].Nat Rev Cancer,2002,2(10):740-749.

[8]Reisman D,Rotter V.The helix-loop-helix containing tran⁃scription factor USF binds to and transactivates the promoter ofthe p53 tumorsuppressorgene[J].Nucleic AcidsRes,1993,21(2):345-350.