韦国兵，胡奇军，廖夫生

HPLC法测定小柴胡颗粒中黄芩苷的含量研究

*韦国兵，胡奇军，廖夫生

（江西中医药大学药学院，江西，南昌 330004）

建立小柴胡颗粒中黄芩苷的含量测定方法。采用高效液相色谱法。色谱柱为Kromasil 100-5 ODS2（5 μm，250 mm × 4.6 mm），柱温25 ℃，流动相甲醇—水—0.1 mol/L磷酸（45:55:0.2），流速为1 mL/min，检测波长280 nm。在上述条件下，黄芩苷在0.00272 μg/mL ~0.0544 μg/mL(r = 0.9997)范围具有良好的线性关系，平均回收率为99.72，RSD = 0.44%。本方法测定小柴胡颗粒中的黄芩苷含量操作简单、准确且快速，可作为小柴胡颗粒中黄芩苷的含量测定方法。

HPLC；小柴胡颗粒；黄芩苷；含量

小柴胡颗粒由柴胡、人参、黄芩、大枣、半夏、生姜、甘草七味药组成，具有解表散热，舒肝和胃之功效。用于寒热往来，胸胁苦满，心烦喜吐，口苦咽干之症状，常用于治疗肝硬化、淋巴腺炎、胆结石、急性胰腺炎、胸膜炎、产褥热、急慢性胆囊炎、胆汁返流性胃炎、胃溃疡等少阳证者[1-2]。黄芩是小柴胡颗粒的主药，黄芩苷的含量高低直接影响着小柴胡颗粒的疗效，有必要对小柴胡颗粒中黄芩苷的含量进行测定。为更好地控制小柴胡颗粒的药品质量，以黄芩苷含量为指标，我院建立了HPLC法测定该制剂中黄芩苷的含量测定方法。

1 仪器与试剂

Agilent1200型高效液相色谱仪；Kromasil100-5c18ODS2（5 μm，250 mm × 4.6 mm）型色谱柱、AB104-N(METTER)电子天平；KQ-100型超声波清洗机（昆山超声仪器有限公司）。

小柴胡颗粒（江西汪氏药业有限公司，批号：20120603，规格：10 g/包）；黄芩苷购自中国药品生物检定所（纯度＞99%）；试剂：甲醇为色谱纯；其余均为分析纯；水为双蒸馏水。

2 方法和结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱Kromasil 100-5 C18(250 mm × 4.6 mm)；流动相：甲醇-水-磷酸(45:55:0.2)；检测波长：280 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；进样量为10 μL。理论塔板数以黄芩苷计算不低于2000。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取干燥的黄芩苷对照品适量于容量瓶中，加甲醇溶解配置成每25 mL含3.4 mg的溶液，超声30 min，加甲醇至刻度得到浓度为0.136 mg/mL的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取小柴胡颗粒适量，用研钵研细，精密称定小柴胡粉末1.6003 g于50 mL容量瓶中，加入50%的甲醇30 mL，超声处理30 min，放冷，继续用50%的甲醇定容至刻度，后精密量取本溶液5 mL于10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶液稀释到刻度，即得供试品溶液[3]。

2.4 测定方法

分别进样对照品溶液和供试品溶液各10 μL 在上述条件下进样，记录色谱图。色谱图如下：

图1 黄芩苷对照品图谱

图2小柴胡颗粒供试品图谱

2.5 线性关系的建立

精密吸取0.136mg/mL的黄芩苷对照品溶液0.2、0.4、1.0、2.0、3.0和4.0mL分别置于10mL容量瓶中，分别加50%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，分别得到0.00272、0.00544、0.0136、0.0272、0.0408、0.0544mg/mL的对照品溶液。分别取以上六种对照品溶液各10μL按2.4项下方法进样，测定峰面积，以进样量X(μg)为横坐标，峰面积Y为纵坐标作线性回归，黄芩苷的线性回归方程为：Y=4746.5x-79.640，r=0.9997，结果表明黄芩苷对照品在0.00272μg/mL ~0.0544μg/mL范围内具有良好的线性关系。

2.6 重复进样精密度实验

取浓度为0.00272 mg/mL的对照品溶液，按2.4项下的方法重复连续进样5次，每次进样10 μL，记录色谱图，测定峰面积，平均峰面积6125，计算RSD = 1.38%（= 5），表明本方法和仪器具有良好的精密度。

2.7 供试品重复性实验

取同一批号（20120603）样品5份，按2.3项下的测定方法操作，制备供试品溶液5份，依次进样，各进样10 μL，测定黄芩苷峰面积，测得黄芩苷含量为1.973 mg/g，计算RSD = 0.39%（= 5），表明本方法具有良好的重复性。

2.8 供试品溶液稳定性试验

取配置好的重复性下的供试品溶液（批号：20120603）一份分别放置0、2、4、6、8和12小时后按上述方法进样，各进样10μL，测定峰面积，计算得RSD=1.02%（=6），表明供试品溶液在室温放置12 h内基本稳定。

2.9 加样回收实验

精密称取已知含量的小柴胡颗粒样品3份，按照供试品溶液的制备方法制成溶液，再分别用移液管精密移取1mL溶液于三只10mL容量瓶中，进行编号，再分别加入供试品中黄芩苷含量的80%，100%，120%的黄芩苷对照品，按供试品溶液的制备方法处理，制备3种供试品溶液共9份，各精密进样10μL进行测定，测定色谱峰面积，测定小柴胡颗粒中黄芩苷的含量并计算平均加样回收率，表明该方法具有较好的回收率。结果见表1。

表1 加样回收实验结果

2.9 样品的含量测定

取3批小柴胡颗粒药品（批号：20120603、20120604、20120605），按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进行含量测定。精密吸取供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，按照外标法根据峰面积计算样品中黄芩苷的含量，结果见表2。

表2 小柴胡颗粒含量测定结果

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择

黄芩苷为一种黄酮衍生物，具有显著的生物活性，其水溶性很小，具有一定的脂溶性，我们分别用甲醇，50%甲醇和70%甲醇作为提取溶剂并超声提取30 min进行提取后测定黄芩苷的含量，结果发现在超声提取30 min时用50%的甲醇溶液作提取溶剂时得到的色谱峰峰型最好[4]，而且分离完全，因此，采用50 %的甲醇作为提取溶剂进行样品中黄芩苷的提取溶剂。

3.2 流动相的选择

本实验对文献提供的色谱条件分别进行了考察分析。韦国兵等在高效液相色谱法测黄芩苷[5-8]的含量基础上，对流动相甲醇—水—磷酸的比例进行试验，发现改变流动相比例会使峰型变化并影响分离效果，最终确定甲醇—水—磷酸（45:55:0.2）为最佳的流动相，在此流动相条件下能排除供试品溶液中其他成分的干扰，分离完全且峰型理想。

4 结论

当前关于小柴胡颗粒中黄芩苷的含量测定方法很多，但以高效液相色谱法最为可靠且操作简单，准确度高。本实验通过对提取溶剂与提取方法、流动相等色谱条件的选择对小柴胡颗粒中的黄芩苷进行快速、准确地定量分析研究结果表明，本方法操作简便、灵敏度高、重现性好，结果可靠；而且与姜春玲文献三相比，本方法具有流动相的分离效果更好、线形范围更宽、峰形理想且其他成分干更小且操作简单、重复性浩的优点，可用于小柴胡颗粒的质量控制。而且与《中国药典》（2010版）方法相比，采用甲醇—水—磷酸（45:55:0.2）为流动相时，更能排除供试品溶液中其他成分的干扰，分离更完全且峰型更理想，分离时间缩短的优点，为小柴胡颗粒的质量标准的提高提供了实验依据。

[1] 吴素琴，姜桂宁.小柴胡汤临床应用近况[J]. 河南中医学药刊,1998,13(5):62.

[2] 李舒敏.小柴胡汤在内科临床上的应用概况[J] . 广西中医学院学报,2000,21(8):495-496.

[3] 姜春玲,李大伟. 小柴胡颗粒中黄芩苷的含量测定[J]. 黑龙江科技信息,2011,5(15):26.

[4] 申去非,张莉,朱铁梁,等.黄芩苷含量测定方法研究进展[J].中医药信息,2009,26(4):14-16.

[5] 韦国兵.HPLC法测定二妙胶囊中盐酸小檗碱的含量[J]. 中国现代医学杂志,2010,20(11):1701-1703.

[6] 孟姝,杨友田,林玉莲,等.利胆片中黄芩苷的含量测定及其质量评价[J].中国药房,2013,24(8):736-738.

[7] 罗王聪,唐雪梅,周健,等.黄芩苷的提取工艺及高效液相含量测定[J].现代中药研究与实践,2012,26(3):53-56.

[8] 刘君, 黎志福, 欧阳春华.三黄滴鼻液中黄芩苷含量测定[J].中国现代药物应用,2011,5(12):12-13.

Determination of baicalin in Yinhuang Oral Liquid by HPLC

*WEI Guo-bing，HU Qi-jun，LIAO Fu-sheng

（Department of Pharmacy, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang, Jiangxi 330004, China）

：To establish a HPLC method for determining the amount of baicalin in Xiaochaihu granules.: HPLC analysis was carried out on a Kromasil 100-5 ODS2 (5 μm, 250 mm × 4.6 mm) column with the temperature at 25 ℃. The mobile phase was methanol- water-0.1 mol/L phosphoric acid ( 45: 55: 0.2) with the flow rate of 1.0 mL·min-1, and the detection wavelength was set at 280 nm.: The linear range of baicalin was 0.00272~0.0544 μg/mL (=0.9997), the average recovery was 99.72%, and the RSD was 0.44%.: The method is simple, rapid, accurate, and can be used for the quality control of the Xiaochaihu granules and its content determination.

HPLC; Xiaochaihu granules; baicalin; content

R944.5

B

10.3969/j.issn.1674-8085.2013.06.016

1674-8085(2013)06-0078-03

2013-08-09；

2013-10-09

江西省教育厅科技计划项目(GJJ10213)，江西中医药大学校级中医药专项(2012-1-10)

*韦国兵(1976-），男，湖南沅江人，副教授，主要从事药物质量标准与中药活性成分研究(E-mail:weigb@163.com);

胡奇军(1975-），男，湖南益阳人，讲师，主要从事药物质量标准与中药活性成分分析(E-mail:weigb@163.com);

廖夫生(1977-），男，江西峡江人，副教授，主要从事药物质量标准与中药活性成分研究(E-mail:lfs960352@163.com).