马小妮，葛宝丰，陈克明，周 建，石文贵，谢艳芳，郭晓宇，吕 享，成 魁，高玉海

兰州军区兰州总医院骨科研究所，兰州 730050

淫羊藿苷调节成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收的机制

马小妮，葛宝丰，陈克明，周 建，石文贵，谢艳芳，郭晓宇，吕 享，成 魁，高玉海

兰州军区兰州总医院骨科研究所，兰州 730050

目的探讨淫羊藿苷(ICA)调节骨形成和骨吸收的机制。方法原代培养大鼠颅骨成骨细胞，茜素红钙化结节染色，加入10-5mol/L ICA 12、24、36、48 h后，用real-time RT-PCR检测骨源性分化的调节基因OSX、Runt相关基因2(Runx- 2)、碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)、骨保护素(OPG)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)基因表达，Western blotting检测OPG、RANKL和Ⅰ型胶原蛋白表达。加入10-5mol/L ICA作用10～90 min，流式细胞仪测定细胞内钙离子浓度。结果与对照组相比，ICA能明显促进骨形成，表现为OSX、Runx- 2、ALP和CollagenⅠ基因表达量及CollagenⅠ蛋白表达量明显增加(P均<0.01)，同时提高细胞内钙离子浓度。ICA也能明显抑制骨吸收，表现为提高OPG及OPG/RANKL基因和蛋白水平的表达量。结论ICA可能是通过促进OSX、Runx- 2、ALP和CollagenⅠ基因表达，提高CollagenⅠ蛋白表达量及细胞内钙离子浓度来促进成骨细胞骨形成；并通过促进OPG及OPG、RANKL基因和蛋白水平的表达量来抑制破骨细胞骨吸收。

成骨细胞；核因子κB受体活化因子配体；骨保护素；淫羊藿苷；流式细胞仪

ActaAcadMedSin，2013,35(4)：432-438

淫羊藿苷(icariin，ICA)为中草药淫羊藿的主要有效成分，本课题组前期研究表明，ICA不但能促进骨髓基质细胞的成骨性分化和成骨细胞的分化成熟[1- 3]，而且能抑制破骨细胞的形成和骨吸收活性[4]，但其都是在诱导剂(地塞米松)和ICA同时存在时观察到ICA对骨髓基质细胞的成骨性分化和成骨细胞的分化成熟的影响，为了阐明ICA自身具有促进成骨细胞的骨形成活性、抑制破骨细胞的骨吸收作用，本研究观察了不加地塞米松时，ICA单独作用对成骨细胞的骨形成活性及对破骨细胞的骨吸收活性的影响，以期为临床治疗骨质疏松提供理论依据。

材料和方法

材料出生48 h以内的SPF级SD大鼠[甘肃省中医学院动物实验中心，合格证号：SCXK(甘)2004- 0006- 152]。标准胎牛血清(FBS)由兰州民海生物公司提供，胰蛋白酶、β-甘油磷酸钠、磷酸化抗坏血酸(ASAP)、地塞米松购自美国Sigma公司，DMEM/F12培养基购自美国Gibco公司，ICA购自中国药品生物制品检定所(纯度>98%)，RNAiso Reagent、反转录试剂盒(Prime ScriptTMreagent Kit)、实时定量PCR试剂盒(SYBR Premix Ex TaqTMⅡ)均购自大连宝生物公司。BCA蛋白定量试剂盒购自武汉博士德公司，Fluo- 3-AM购自兰州凯基生物公司，兔多克隆抗体OPG购自美国Santa Cruz公司，兔多克隆抗体RANKL购自美国CST公司，兔多克隆抗体Collagen Ⅰ购自美国Abcam公司，小鼠多克隆抗体β-actin、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/山羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物公司，PVDF膜购自美国Pierce公司。蛋白垂直电泳装置购自美国Bio-Rad公司，FACScalibur 流式细胞仪购自美国Becton-Dickinson公司，倒置相差显微镜购自日本OLYMPUS公司，紫外分光光度计和台式高速冷冻离心机购自德国Heraeus公司，实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

成骨细胞分离培养及加药处理出生48h内的SPF级SD大鼠，75%乙醇浸泡无菌条件下取出头盖骨，置入盛有培养基的培养皿中，去除骨膜、血管及结缔组织，PBS漂洗2次，加入0.25%胰酶于37 ℃消化10 min，弃掉消化液，再加入0.1%Ⅱ型胶原酶37 ℃消化3次，每次15 min，收集并合并消化液，200目细胞筛过滤，收集消化液用1000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀用含有10% FBS的DMEM培养基悬浮，吹打均匀后，调整细胞浓度至1×105个/ml。37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每3d换液1次。待细胞生长至85%左右时加入终浓度为1×10-5mol/L的ICA分别培养12、24、36、48 h。

成骨细胞钙化结节染色将传代后的成骨细胞接种在35 mm培养皿中，待细胞形成钙化结节时对其进行染色，具体方法如下：弃培养液，PBS冲洗2次，加入4%多聚甲醛固定10 min；弃固定液，加入pH 8.9、0.1%的茜素红染色液，37 ℃水浴1 h，流水冲洗，换固定液照相记录结果。

real-timeRT-PCR检测各基因表达弃掉加药至12、24、36、48 h的成骨细胞培养液，PBS漂洗2次，加入1 ml Trizol裂解细胞，收集裂解液；加入200 μl氯仿混匀后室温放置5 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液；加入等体积异丙醇，混匀后室温放置15 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清液；加入1 ml 75%乙醇洗涤沉淀，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，弃上清液；加入40 μl无RNA酶ddH2O重悬沉淀，-80 ℃保存备用。取2 μl总RNA，加入98 μl无RNA酶ddH2O，紫外分光光度计测定260、280和320 nm处的光密度值(A)，计算A260 nm/A280 nm值及RNA浓度。其中2.1>A260 nm/A280 nm值>1.9、RNA浓度>0.4 g/L的样品可用于下一步实验。逆转录反应制备cDNA，按照TaKaRa Prime ScriptTMReagent Kit 说明书合成cDNA-20 ℃保存备用。PCR扩增cDNA，按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ说明书添加PCR反应体系，反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火31 s，进行40个循环扩增目的基因，检测骨源性分化的调节基因OSX、Runt相关基因2(runt-related transcription factor 2，Runx- 2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、I型胶原(Collagen I)、骨保护素(osteoprotegerin，OPG)和核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)基因表达，合成的引物序列见表1，RT-PCR数据处理采用2-ΔΔCt法。

Westernblotting检测OPG、RANKL和CollagenⅠ等相关蛋白表达弃掉加药至12、24、36、48 h的成骨细胞培养液，PBS漂洗2次，加入300 μl细胞裂解液RIPA，冰上静置15 min后收集裂解液，-20 ℃保存备用。将上述裂解产物反复冻融裂解3次，12 000 r/min离心30 min，按照BCA- 200蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量，取20 μg蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，转移至PVDF膜上用封闭液封闭后，分别加入1∶1000的兔抗OPG、RANKL与CollagenⅠ和1∶1000小鼠抗β-actin，室温振荡2 h，洗涤3次，分别加入1∶10 000与1∶5000辣根过氧化酶标记的羊抗兔和羊抗鼠二抗，室温孵育1 h，TBST漂洗后ECL显色，结果用图像分析软件Scion Image beta 4.0分析灰度值，比较各组细胞OPG、RANKL和CollagenⅠ相对表达水平。

流式细胞术测定细胞内钙离子取对数生长期的成骨细胞，PBS漂洗2遍，加入终浓度为15 μmol/L的Fluo- 3/AM染液，置CO2培养箱中孵育30 min，PBS漂洗2遍，1500 r/min离心5 min去掉多余的染料。向上述细胞中加入终浓度为1×10-5mol/L的ICA分别作用10～90 min，流式细胞仪测定各时间点样本的荧光强度，重复3次。按照下列公式计算细胞溶质中钙离子的浓度：钙离子浓度=Kd×(F-Fmin)/(Fmax-F)，式中Kd是Ca2+结合Fluo- 3/AM的解离常数，37 ℃下为204 nmol/L。F为各样本荧光强度的测定值，Fmax和Fmin分别是最大荧光强度和最小荧光强度的测定值，其测定方法为：在不加药的、负载好荧光染料的试管中加入终浓度60 g/L的TritonX- 100、5 mmol/L的CaCl2，超声混匀，静置10 min后用流式细胞仪测定平均荧光强度，即Fmax；在不加药的、负载好荧光染料的试管中加入终浓度为25 mmol/L的EDTA，超声混匀，静置10 min后用流式细胞仪测定平均荧光强度，即Fmin[5]。

表 1 RT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences of RT-PCR

OSX：骨源性分化的调节基因；Runx- 2：Runt相关基因2；OPG：骨保护素；RANKL：核因子κB受体活化因子配体；ALP：碱性磷酸酶

OSX：osterix；Runx- 2：runt-related transcription factor 2；OPG：osteoprotegerin；RANKL：receptor activator of nuclear factor-κB ligand；ALP：alkaline phosphatase

统计学处理采用SPSS 16.0统计软件，实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

成骨细胞形态观察细胞培养72 h开始融合成单层，细胞形态清晰呈长梭形、三角及多角等形状，培养至12d左右时形成钙化结节(图1)。

ICA对成骨基因OSX、Runx-2、CollagenI和ALP的影响ICA作用成骨细胞24 h能够明显地提高OSX、Runx- 2和ALP基因mRNA表达量，与对照组相比差异均有统计学意义(P均<0.01)，OSX、Runx- 2和ALP mRNA表达量分别是对照组的8.4、6.6和5.6倍；ICA作用成骨细胞12 h能够明显提高CollagenⅠ mRNA表达量，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)，CollagenⅠ mRNA表达量是对照组的4.4倍(图2)。

ICA对OPG和RANKL基因表达量及其比值的影响ICA作用12和24 h时，OPG表达量略有升高，但与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；ICA作用36 h时，OPG表达量显著升高，为对照组的6.2倍(P<0.01)；ICA作用48 h时，OPG表达量下降。RANKL的表达量在ICA作用12、24 h时有所升高，但与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；作用36、48 h时下降，与对照组相比差异也无统计学意义(P>0.05)。OPG和RANKL的比值趋势与OPG相同，即36 h时显著高于对照组(P<0.01)，48 h时下降至对照组水平(图3)。

A.培养72h的成骨细胞形态；B.培养至12d形成的钙化结节；C.茜素红染色的钙化结节

A.a image of osteoblasts cultured for 72 hours；B.a image of mineralized nodules formed after culture for 12 days；C.a image of alizarin red-stained mineralized nodules

图1 不同时期成骨细胞形态观察(×100)

Fig1 Morphologies of osteoblasts at different time points(×100)

Runx- 2：Runt相关基因2；OSX：骨源性分化的调节基因；ALP：碱性磷酸酶；ICA：淫羊藿苷；与对照组比较，aP<0.01

Runx- 2：runt-related transcription factor 2；OSX：osterix；ALP：alkaline phosphatase；ICA：icariin；aP<0.01 compared with control group

图2 ICA对成骨基因OSX、Runx- 2、Collagen Ⅰ和ALP的影响

Fig2 Effects of ICA on the mRNA levels of Runx- 2，OSX，ALP and CollagenⅠ

OPG：骨保护素；RANKL：核因子κB受体活化因子配体；与对照组比较，aP<0.01

OPG：osteoprotegerin；RANKL：receptor activator of nuclear factor-κB ligand；aP<0.01 compared with control group

图3 ICA对成骨细胞OPG、OPG/RANKL表达的影响

Fig3 Effects of ICA on the mRNA expression of OPG and OPG/RANKL

ICA对CollagenI、OPG、RANKL蛋白表达的影响ICA处理36 h时，OPG的表达明显高于对照组(P<0.01)，12 h和48 h组与对照组相比差异无统计学意义(P均>0.05)；24 h时OPG蛋白表达量有所升高，但与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；RANKL的表达在12、24、36、48 h均与对照组差异无统计学意义(P均>0.05)。OPG和RANKL蛋白表达量的比值与图3中基因的表达趋势基本一致。ICA处理12 h时，CollagenⅠ蛋白表达量显著升高，为对照组的6.2倍，24、36和48 h时下降至对照组水平(图4、5)。

ICA对成骨细胞胞浆中钙离子浓度的影响ICA作用10 min时，钙离子有明显升高；作用20 min时，瞬间极大提高了钙离子浓度并达到最高值；作用30 min时，钙离子浓度略有下降但仍高于作用10 min时；作用40～50 min时，钙离子再次上升，并于50 min时达到最大值，但低于20 min时；作用60～90 min时，钙离子的浓度趋于下降水平，80～90 min时下降至基线水平(图6)。

图4 Western blotting检测ICA对成骨细胞OPG、RANKL、Collagen Ⅰ蛋白表达的影响

Fig4 Effects of ICA on the protein expression of OPG，RANKL，and Collagen I as measured by Western blotting

与对照组比较，aP<0.01

aP<0.01 compared with control group

图5 Western blotting检测ICA对成骨细胞OPG、RANKL、Collagen Ⅰ表达影响的统计分析

Fig5 Effects of ICA on the protein expression of OPG，RANKL and Collagen Ⅰ as measured by Western blotting using Image-Pro Plus 6.0 software

图6 ICA对细胞溶质中钙离子的影响

Fig6 Effects of ICA on cytosolic calcium

讨 论

ICA是淫羊藿的主要有效成分之一，本研究主要探讨了在不加诱导剂(地塞米松)的条件下，ICA对成骨细胞成骨活性的影响及破骨细胞骨吸收活性的影响。结果显示，ICA单独作用24 h时，能明显提高OSX、Runx- 2和ALP基因的表达量。OSX是一种对成骨细胞分化很重要的转录因子，前成骨细胞分化为成熟的有功能的成骨细胞需要OSX的存在[6-7]，Runx- 2在成骨细胞的分化、成熟中发挥重要作用，同时Runx- 2蛋白参与成骨形成的早期阶段[8]。ALP是成骨细胞分化的早期指标，在成骨细胞的骨形成过程中，其数量和功能直接影响骨形成能力。由此推测，ICA可能是通过提高上述基因的表达量，促进成骨细胞的骨形成活性。

本研究结果显示，ICA单独作用12 h时，能显著提高CollagenⅠ基因和蛋白的表达量。已知成骨细胞骨形成的最初阶段能分化合成并分泌大量的Collagen Ⅰ蛋白，从而促进成骨细胞的骨形成活性。

本研究中，ICA单独作用10～90 min，可提高成骨细胞胞浆钙离子浓度，20 min时达到最高值，50 min时再次使胞内钙离子升高，但不及20 min时。钙离子是普遍存在的细胞内第二信使[9]，其变化可作为一种信号引起明确的生理效应，例如钙离子升高可激活内皮型一氧化氮合酶[10]。已有研究报道，内皮型一氧化氮合酶参与了骨分化与形成[11]，由此推测胞内钙离子的升高可能也与ICA促进成骨细胞的骨形成活性有关。

目前认为，破骨前体细胞分化发育为成熟破骨细胞的过程中受骨髓基质细胞或成骨细胞分泌的RANKL与OPG调节。OPG主要通过与RANKL直接结合，竞争性抑制RANKL与RANK的结合，从而抑制破骨细胞分化和骨吸收活性[12-13]。OPG/RANKL的比值决定了破骨细胞的命运，比值降低则骨吸收增强；比值升高，则骨吸收降低。本研究结果显示，ICA单独作用36 h能显著提高OPG基因和蛋白的表达；ICA单独作用12、24、36、48 h，RANKL的表达有所上升，但与对照组相比差异无统计学意义。OPG/RANKL比值的变化趋势与OPG相似，即36 h OPG/RANKL比值最高。上述结果提示，ICA可能主要是通过提高OPG及OPG/RANKL的比值，发挥抑制破骨细胞的骨吸收活性。

综上，本研究结果显示，ICA可能是通过促进OSX、Runx- 2、ALP和Collagen Ⅰ 基因表达，提高Collagen Ⅰ 蛋白表达量及细胞内钙离子浓度来促进成骨细胞骨形成；并通过促进OPG及OPG、RANKL基因和蛋白水平的表达量来抑制破骨细胞骨吸收。

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MechanismsofIcariininRegulatingBoneFormationofOsteoblastsandBoneResorptionofOsteoclasts

MA Xiao-ni，GE Bao-feng，CHEN Ke-ming，ZHOU Jian，SHI Wen-gui，XIE Yan-fang，GUO Xiao-yu，LÜ Xiang，CHENG Kui，GAO Yu-hai

Institute of Orthopaedics，Lanzhou General Hospital，Lanzhou Command of PLA,Lanzhou 730050，China

CHEN Ke-ming Tel：0931- 8994327，E-mail：chenkm@lut.cn

ObjectiveTo investigate the molecular mechanisms of icariin(ICA)in regulating the bone formation of osteoblasts and the bone resorption of osteoclasts.MethodsPrimary osteoblast cell cultures were obtained from newborn rat calvarial.Calcified nodules were stained by alizarin red.The mRNA levels of osterix(OSX)，runt-related transcription factor 2(Runx- 2)，alkaline phosphatase(ALP)，CollagenⅠ，osteoprotegerin(OPG)，and receptor activator of nuclear factor-κB ligand(RANKL)were analyzed by quantitative real-time RT-PCR，the protein levels of OPG，RANKL，and CollagenⅠ were examined by Western blotting，and the intracellular Ca2+concentration of osteoblasts was measured on a flow cytometer using the Cellquest program.ResultsCompared with control group，ICA markedly promoted bone formation by significant up-regulating the gene expressions of OSX，Runx- 2，ALP，and CollagenⅠ，the protein expression of CollagenⅠ(allP<0.01)，and the Ca2+concentration.Furthermore，ICA remarkably inhibited bone resorption by significant up-regulating the mRNA and protein expressions of OPG as well as the OPG/RANKL ratio.ConclusionsICA could promote bone formation of osteoblasts through inducting the gene expressions of OSX，Runx- 2，ALP and CollagenⅠ，and the protein expressions of CollagenⅠ，and by increasing the Ca2+concentration.Moreover，ICA could inhibit bone resorption of osteoclasts through regulating OPG/RANKL signal pathway.

osteoblasts；receptor activator of nuclear factor-κB ligand；osteoprotegerin；icariin；flow cytometry

陈克明 电话：0931- 8994327，电子邮件：chenkm@lut.cn

R977；R96

A

1000- 503X(2013)04- 0432- 07

2012- 07- 03)

甘肃省科技重大专项资助项目(09ZNKDA025)Supported by the Major Science and Technology Project of Gansu Province(09ZNKDA025)

10.3881/j.issn.1000- 503X.2013.04.014