文 雯，徐先林，欧刚卫

(遵义医学院 生物化学教研室，贵州 遵义 563099)

多种抗生素抗性基因在儿童肠道菌群的携带状况

文 雯，徐先林，欧刚卫

(遵义医学院 生物化学教研室，贵州 遵义 563099)

目的了解儿童肠道菌群中多种抗生素抗性基因的携带情况。方法采集3～5岁儿童粪便标本，分别为3月内未使用抗生素标本8例和1～3周内使用过头孢类抗生素标本8例。提取粪便细菌总DNA，PCR分析抗生素抗性基因。结果在两组各7例样本中检出四环素抗性基因tetB，两组全部样本中均检出大环内酯类抗生素抗性基因ermB，1～3周内使用过头孢类抗生素儿童中β-内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM检出数高于对照组。结论儿童肠道菌群中普遍存在四环素抗性基因tetB和大环内酯类抗生素抗性基因ermB，短期使用头孢类抗生素儿童粪便中携带β-内酰胺酶类抗生素抗性基因blaTEM数较3月内未使用抗生素儿童数多。

肠道菌群；抗生素抗性基因；儿童

抗生素广泛应用于人类医疗和畜牧、水产业中，对疾病防治或促进动物的生长发育有着十分重要的作用。长期以来，大量和不规范地使用抗生素，对环境和人类健康已经构成巨大的潜在威胁。环境的筛选压力使细菌耐药菌株在数量、多样性以及抗性强度上都显著增加[1]。抗生素抗性基因(Antibiotic Resistant Genes，ARGs)随细菌在环境中传播、扩散, 对公共卫生构成威胁。

我们采用PCR方法，探讨遵义市3～5岁儿童肠道菌群中多种ARGs的携带情况及短期使用头孢类抗生素对β-内酰胺酶类抗生素抗性基因的影响。

1 资料与方法

1.1 标本采集、分组 在遵义市幼儿园采集3～5岁健康儿童粪便样本，3个月内无抗生素使用史样本8例(对照组)其中男孩4例，女孩4例；1～3周内有头孢类抗生素使用史样本8例(抗生素组)其中男孩5例，女孩3例。对照组儿童平均年龄为4.75岁，抗生组儿童平均年龄为4.11岁(见表1)。标本采集后，在4 ℃条件下送至实验室，置-80 ℃保存备用。

表1样本儿童的年龄分布(n=8)

组别年龄平均值标准差范围(最大值、最小值)对照组 4.74.7±0.365.1,3.8抗生素组4.14.1±1.105.2,2.5

1.2 样本细菌DNA提取 粪便基因组DNA快速提取试剂盒说明书(天根生化科技有限公司，北京)提取样本DNA。取180～220 mg粪便样本至2 ml离心管中，加入缓冲液GSL高温裂解，再逐步加入抑制吸附片lnhibitEX、蛋白酶K和无水乙醇反复多次离心后，将所得溶液加入到吸附柱CR2中，离心后加入缓冲液TB，收集所得液体。将提纯的DNA进行纯度和浓度测定，浓度在50 ng/μL以上，OD260/OD280在1.8～2.0的DNA样品可直接用于后续实验。部分标本DNA纯度较差的进行DNA纯化处理后再行后续试验。

1.3 抗生素抗性基因扩增 四环素类抗生素抗性基因tetB上游引物：TACGTGAATTTATTGCTTCGG，下游引物：ATACAGCATCCAAAGCGCAC[2]。大环内脂类ermB基因上游引物：CTATCTGATTGTTGAAGAAGGATT，下游引物：GTTTACTCTTGGTTTAGGATGAAA[3]。β-内酰胺类抗生素抗性基因TEM上游引物:KACAATAACCCTGRTAAATGC，下游引物: AGTATATATGAGTAAACTTGG。R, wobble (A + G), K，wobble (G + T)[4]。采用PCR Master Mix K 1081试剂盒(Fermentas公司，上海)进行PCR扩增，反应体系为上游引物(10 pmol/μl)2 μL，下游引物(10 pmol/μL)2 μL，DNA100 ng，PCR Master Mix(2×) 25 μL，用去离子水补充体积至50 μL。PCR扩增条件：大环内酯类ermB基因：95 ℃ 3 min；95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃45 s共35个循环；延伸72 ℃7 min。四环素类tetB基因：94 ℃5 s；61 ℃30 s，72 ℃30 s共25个循环，取产物2 μL后，按照上述体系加入PCR Master Mix(2×)和去离子水，94 ℃5 s；61 ℃30 s，72 ℃30 s共25个循环，延伸72 ℃7 min。将扩增后的反应产物取4.5 μL经1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

1.4 PCR产物测序 将PCR扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司(上海生工，上海)测序，用BLAST(the Basic Local Alignment Search Tool)在GenBank进行比较分析。序列比较相似性≥97%的为同一基因。

2 结果

2.1 四环素类抗生素抗性基因检测 四环素类抗生素抗性基因tetB PCR 结果显示，两组样本中分别在7个样本中检测到tetB。DNA序列测定结果证实扩增条带为tetB基因(见图1)。

2.2 大环内酯类抗生素抗性基因检测 大环内酯类抗生素抗性基因ermB PCR 结果显示，两组样本中所有样本均检测到ermB基因。DNA序列测定结果证实扩增条带为tetB基因(见图2)。

2.3 β-内酰胺类抗生素抗性基因检测 β-内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM在对照组8例标本中仅在4号标本检测出目标基因，1～3周内使用过头孢类抗生素儿童中有3例标本检测出目标基因(见图3)。

3 讨论

在人体消化道，肠道自身环境及细菌性质等因素决定了肠道菌群的组成。抗生素的广泛使用导致的环境选择压力，耐药菌株的数量、多样性以及抗性强度都显著增加[1]。人们不仅关注抗生素对环境的影响, 更将抗生素抗性基因的传播以及对人体健康的影响作为关注的焦点，相关的研究报道迅速增加[ 5-8 ]。现今在饮用水、空气、河流、土壤等环境介质中已发现多种抗性基因如β-内酰胺类抗性基因、四环素类抗性基因、磺胺类抗性基因等[5]。环境中细菌组成及耐药菌株，对定植肠道的菌群组成及菌群中携带耐药基因的细菌数量和种类以及由此对宿主的影响尚待研究。已有研究表明，长期或短期使用抗生素可导致肠道共生菌群组成的变化[9-10]，而肠道微生态的改变对宿主产生多方面的影响，包括免疫系统发育[11]、抗感染及多种代谢性疾病[12]。肠道菌群中耐药基因的种类及耐药基因在肠道菌群中不同细菌之间的传播，可能导致多种耐药菌株的产生。Sapkota等[13]在大型养猪场室内空气中发现大环内脂抗生素抗性基因ermB等多类抗性基因。胡建英等[5]在中国温榆河流域中检测到tetB等多种四环素类抗性基因。目前国内外报道最多的是抗生素抗性基因在环境中的分布状况，而在人体内的分布状况及其传播途径仍不清楚。我们分析了遵义市幼儿园3～5岁健康儿童肠道菌群耐药基因携带情况，结果显示，虽然受试儿童并没有明确使用四环素和大环内脂类抗生素的历史，而在几乎所有样本中，检出四环素类抗生素抗性基因tetB以及大环内脂类抗性基因ermB基因。说明四环素类抗生素抗性基因tetB及大环内脂类抗性基因ermB基因不仅存在于环境中，在人肠道菌群中也同样存在。而短期内使用头孢类抗生素儿童，肠道菌群中耐β-内酰胺酶类抗生素抗性基因blaTEM多于未使用头孢类抗生素组。四环素类抗生素曾广泛应用于临床，由于常见病原菌对本类药物耐药性普遍升高及其不良反应多见，目前本类药物临床应用已受到很大限制，尤其是在儿童中几乎不再使用，但在畜牧、水产等领域仍广泛使用。由结果表明，在儿童肠道菌群建立过程中，某些环境中携带有耐药基因的细菌定植于肠道，短期使用某些抗生素如头孢类抗生素，会导致肠道菌群中携带有β-内酰胺酶类抗生素抗性基因blaTEM明显。

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[收稿2012-12-21;修回2013-02-27]

(编辑：谭秀荣)

Studyonthecarryingstatusofantibioticresistancegenesinchildrenintestinalflora

Wenwen,Xuxianlin,Ougangwei

(Department of Biochemistry, Zunyi Medical University, Guizhou Zunyi 563099, China)

ObjectiveTo investigate the carrying status of antibiotic resistance genes in children intestinal flora.MethodsSixteen feacal samples from 3 to 5 year-old children in Zunyi were collected in this study including 8 cases without any antibiotic treatment in three months as control group and 8 cases receiving cephalosporins treatment within 1 to 3 weeks as treatment group. The antibiotic resistant genes in feacal samples were analyzed by PCR after DNA extraction.ResultsThe macrolide antibiotics resistance gene ermB was detected in all samples and the tetracycline resistance gene tetB was showed in 7 cases of each group. The detection rate of β-lactam antibiotic resistance gene blaTEMin treatment group was higher than that in control group.ConclusionermB and tetB are widely distributed in children intestinal flora. The administration of antibiotics such as cephalosporins could aggravate the emerging antibiotic resistant genes in children intestinal flora.

intestinal flora; antibiotic resistance genes; children

R372

A

1000-2715(2013)02-0113-03

贵州省科技厅基金项目(NO:C-487);遵义医学院博士启动基金项目(NO:F-391)。

欧刚卫，男，教授，硕士生导师，研究方向：肠道免疫和肠道菌群，E-mail:gangwei.ou@zmc.edu.cn。