王 湘，李润成

（湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 410131）

副猪嗜血杆菌引起的疾病又叫做革拉泽氏病（Glasser’s Disease），可感染2周龄到4月龄的青年猪。临床上表现为呼吸综合征，特异性表现为纤维素性浆膜炎、关节炎、肺炎以及急性败血病。副猪嗜血杆菌内毒素可引起弥漫性血管内凝血，导致不同组织微血栓的形成[1]。本文对湖南耒阳一猪场保育猪的发病情况做了简要介绍，并对该猪场的保育猪发生副猪嗜血杆菌感染进行了细菌分离及疾病的诊断分析，现报告如下：

1 材料和方法

1.1 病料来源

湖南耒阳某猪场送检的保育猪6头，其中发病早期的1头、中期的2头、后期的3头。（该猪场自2012年9月份开始50～80日龄的保育猪陆续出现皮毛粗乱，食欲减退，后期四肢肿大，不能站立的情况。发病率20%～30%左右，保育舍小猪总死亡率达10%左右）。

1.2 主要的试剂及培养基

Taq- plus 酶，dNTP、DNA Marker，革兰氏染色试剂盒，巧克力培养基，血琼脂培养基，TSB 培养基，NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸），小牛血清。

1.3 送检病猪的临床与解剖病变观察

将送检病猪放于解剖室观察其外部特征及行为表现后按常规方法处死并进行解剖观察、采样。

1.4 细菌的分离

从采集的病猪脾脏、肺脏、关节液无菌钩取组织样本，划线接种于巧克力及血琼脂平板后，巧克力平板放于烛缸进行培养，血平板直接放于恒温箱中，37℃培养48 h后观察细菌生长情况。

1.5 细菌的增菌培养及PCR鉴定

挑取形态上具有代表性的单个菌落划线接种巧克力培养基，待菌落长出后进行革兰染色镜检和PCR鉴定。PCR鉴定采用细菌通用引物进行，引物资料见文献[2]，PCR方法按常规操作，并于PCR扩增后将产物送铂尚生物技术有限公司测序鉴定。

1.6 药敏试验

挑取纯培养的单个菌落，于含100μg/mL N A D的T S B液体培养基中进行增菌培养后采用纸片法进行药敏检测。

2 结果

2.1 送检病猪的临床表现及解剖病变

从送检的病猪可见6头小猪均表现出消瘦，皮毛粗乱（图1），其中有3头发病后期的小猪四肢肿大(图2)。6头猪中只有2头发病后期的猪表现出胸腔有严重的纤维素性渗出，1头发病中期的小猪脾脏明显肿大。其他均未见到严重病变。

2.2 细菌的分离、鉴定结果

2.2.1 细菌分离及革兰染色镜检结果

从采集的6头小猪脾脏、肺脏、关节液分别无菌钩取组织，划线接种巧克力及血琼脂平板。结果1头发病初期以及2头发病中期小猪脾脏接种的巧克力平板长出了一些形态一致的针尖大小菌落。其他均未见到细菌生长。划线培养的细菌革兰染色镜检均为丝状阴性细菌（见图3）。

2.2.2 PCR鉴定结果

挑取纯培养的细菌进行PCR 扩增，并于PCR扩增后将产物送铂尚生物技术有限公司测序。将测出序列进行Blast 分析发现此次分离的菌株为副猪嗜血杆菌，为了进一步确认该菌株的血清型，使用Lasergene 分析软件中的MegAlign 程序，运用Clustal W方法对所测序列与参考序列进行比较，并绘制和分析遗传进化树（图4）。结果表明，该菌株（LY.seq）与GenBank 中登录的部分1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、14 血清型的16S rRNA 同源性为96.3%~99.0%，与GenBank登录号为AB078974 以及AB078974 的两株血清5 型的菌株构成一个分支，同源性高达99.0%。因此将该分离株最后确认为HPS 血清5 型细菌。

2.3 药敏结果

挑取纯培养的单个菌落，于含100 μg/mL NAD的TSB 液体培养基中进行增菌培养后，采用纸片法进行药敏检测。抑菌圈直径在15 mm以下，判为该菌对药物低度敏感；直径在15 mm～20 mm之间判为中度敏感；大于20 mm判为细菌对该药极度敏感，建议此类药物作为临床用药的首选。试验结果见表1。

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由表1可见该细菌对头孢噻吩、先锋霉素V、强力霉素、氯霉素等药物高度敏感，对庆大霉素、新霉素、环丙氟哌酸等药物中毒敏感，对链霉素低度耐药。

3 讨论

猪是副猪嗜血杆菌的天然宿主。随着养猪业的发展，副猪嗜血杆菌引起的疾病感染在我国各地也屡见不鲜且日益严重，疾病感染导致的高死亡率以及应用大量抗生素治疗给广大养殖户带来了巨大的经济损失。在一个猪群中，副猪嗜血杆菌的致病力是影响全身疾病严重程度或发生、发展的因素，通常可以从猪的上呼吸道分离出该菌的一些血清型，这其中包含了一些很少能从全身其他部位分离出的血清型，分离细菌的部位常影响副猪嗜血杆菌病判定的精确性。副猪嗜血杆菌可作为猪呼吸道疾病综合征的病原体，也可以作为一种易感病原，或是作为引起肺炎的次要或主要病原体。当动物机体感受到外部环境产生的压力，如不良的饲养环境，断奶、转群、运输等或生猪存在蓝耳病毒感染时，副猪嗜杆菌对生猪造成感染发病的机率会大大增加。单纯的HPS感染时引发的临床症状、剖检病变以及流行病学特征与传染性胸膜肺炎、支原体肺炎、以及猪的链球菌感染均有相似之处，在临床上也很难进行区分，所以在对该菌的感染进行确诊时需要借助实验室检测手段。

副猪嗜血杆菌 15种血清型中 1、5、10、12、13、14为高致病性毒株；血清型2、4、15为中等毒力株；3、6、7、8、9、11为低致病力毒株，且感染猪后没有明显的临床症状[3，4]，其中还有20%的菌株未能进行分型。运用PCR方法扩增细菌的16 SrRNA后进行测序，将得到的序列与Gen Bank中的各血清型序列进行比较，可以方便快速的鉴定副猪嗜血杆菌，提高了诊断HPS感染的效率。而且随着分离菌株的增加，利用此方法也可以更好的收集HPS跟血清型感染的数据，为副猪嗜血杆菌病的防制提供了科学的参考依据。

此次送检的病猪为6头，病猪表现的临床症状相似，结果却只在发病的3头小猪脾脏中分离到副猪嗜血杆菌，而在小猪明显肿大的关节腔中却未分离到细菌。经过调查了解到该猪场在病猪送检之前曾使用了大量的抗生素进行治疗，这可能是在关节液与肺脏中未分离到病原菌的原因之一。此次细菌分离提示临床诊断副猪嗜血杆菌病例应选用发病早期，且未经抗生素治疗的病猪作为诊断对象比较可靠。畜主在使用抗生素之前也应对抗生素的种类进行挑选与分析，避免盲目用药后病原菌产生耐药性。本文将该猪场保育猪病例诊断为存在副猪嗜血杆菌感染，并进行药物敏感性检测，建议猪场采用敏感药物进行药物保健与防控，取得了一定的效果。 □

[1] Amano H.,Shibata M.,Kajio N.,Morozumi T.Pathologic observations of pigs intranasally inoculated with serovar 1,4 and 5 of Haemophilus parasuis using immunoperoxidase method[J].Journal of Veterinary Medical Science,1994,56,639～644.

[2] Run-Cheng LI,Chao-Ting Xiao,Xing Qian,et al.Occurrence of Streptococcus dysgalactiae subsp.equisimilis in Masked Palm Civet(Paguma larvata)[J].Journal of Animal and Veterinary Advances,2012,11(12)：2020～2023.

[3] Nielsen R.Pathogenicity and immunity studies of Haemophilus parasuis sexotypes[J].Acta Vet Scand,1993,34(2)：193～198.

[4] Kielstein P,Rapp-Gabrielson V J.Designation of 15 serovars of Haemophilus parasuis on the basis of immunodiffusion using heat-stable antigen extracts[J].J Clin Microbiol,1992,30：862～865.