高温胁迫下百脉根生理生化响应及耐热性评价

2013-10-17赵丽丽王普昶

草业科学 2013年12期

赵丽丽，王普昶，陈超，马林

（1.贵州大学动物科学学院草业科学系，贵州贵阳550025；2.贵州省草业研究所，贵州贵阳550025）

百脉根（Lotuscorniculatus）是豆科百脉根属多年生草本植物，别名瘠地苜蓿、五叶草。其株型低矮、匍匐，耐热性强，夏季一般牧草生长不良时，百脉根仍能良好生长，是水土保持和果园生草的理想草种［1－2］。具有营养丰富、茎叶柔软细嫩多汁、适口性好、皂素含量低、家畜饲用安全等特性，可用于刈割青饲、调制干草、加工草粉和混合饲料等，被认为是中国温带亚热带地区极具发展潜力的优良牧草［3－5］。中国很多地区曾从国外引种栽培，虽在各地生长良好，但都未在生产中推广应用，优良品种缺乏是其主要限制因子之一。我国野生百脉根种质资源丰富，广泛分布于河北、云南、贵州、四川和甘肃等地［1］。但目前针对野生百脉根种质资源的评价、筛选研究较少，因此，加大对野生百脉根种质资源的评价、筛选可以有效地推进百脉根新品种的培育工作。

高温是植物生长过程中最常见的逆境因子之一，严重影响植物生长及其产量和品质［6］，其对植物的危害规律也一直是学术界关注的热点。植物耐热性受植物对高温胁迫的适应性及环境条件的复杂性等多因子影响，属于多基因控制的数量性状［7］，利用个别或少数指标的简单比较难以真实地反映植物耐热性的遗传本质［8－10］。主成分分析能够在较少损失原有信息的前提下，把多个彼此相关的指标简化为少数几个相互独立的综合指标［11］。隶属函数法是根据模糊数学原理，利用多个指标隶属函数值的累加值，综合评估植物的耐热性。将主成分分析与隶属函数法相结合，并综合考虑各综合指标的权重，经加权求和评价植物的耐热性，既能充分利用各指标间的深层次联系，弥补和缓解单个指标或多个指标直接评定的片面性和重复性，又能兼顾各综合指标的贡献度，使评价结果与实际结果更为接近。该方法在评价植物的耐热性方面，得到了很多学者的认可［7－11］。百脉根种质的适应性研究主要集中在抗旱性鉴定方面［12］，耐热性研究少见报道。为探索百脉根耐热机制及耐热指标，评价各种质的耐热性，本研究以正常温度与高温胁迫条件下8个百脉根种质为研究对象，测定其在高温胁迫下的6个生理生化指标，应用主成分分析、隶属函数法，经加权求和综合评价8个百脉根种质的耐热性，初步筛选出耐热性强的百脉根种质，以期为发掘优良基因、遗传改良及新品种培育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 8份供试百脉根种质材料分别是B01、B02、B03、B04、B05、B08、B12和 B18。B01、B02、B03和B04为中国农科院草原研究所中期库收集入库的野生种质材料，分别来源于日本、加拿大、内蒙古和贵阳；B05为市售百脉根品种，南方型；B08、B12和B18分别采自贵州省的施秉、威宁和纳雍。

1.2 试验方法

1.2.1 高温胁迫处理方法 2011年4月将百脉根种子播种于由河沙、蛭石和腐殖质土按1∶1∶1混合的花盆中，置于室外进行日常养护，两个月后置于温室中进行胁迫试验，分别设置22℃（对照）、35℃和45℃处理，每处理设3次重复。温室内空气相对湿度80%。在各盆底放置托盘，托盘中放置一定量的水分（水深1.0～1.5cm）补充基质水分。胁迫处理6d后，随机采集植株中部叶片，测定生理生化指标。

1.2.2 生理生化指标测定方法参照李合生［13］和邹琦［14］的方法，叶片相对电导率用雷磁DDSJ－308A型电导仪测定；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）显色法测定；游离脯氨酸（Pro）含量采用酸性茚三酮法测定；超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性分别采用NBT光化还原法、愈创木酚氧化法和紫外分光光度法测定［15］。以上测定均重复3次。

1.3 数据处理与统计分析运用SPSS 17.0软件和Excel 2007对试验数据进行方差分析（ANOVA，P＜0.05），主成分分析［16］和隶属函数计算。

1.3.1 隶属函数分析试验材料各主成分的隶属函数值按公式（1）［11］求得。

式中，U（xi）为各种质第i个主成分的隶属函数值，xi为各种质某一主成分得分值，ximax和ximin分别为所有参试种质中第i个主成分的最大值和最小值。

1.3.2 权重根据主成分的贡献率的大小按公式（2）［9］计算各主成分的权重。

式中，Wi表示第i个主成分在所有主成分中的重要程度；pi为各种质第i个主成分的贡献率。

1.3.3 综合评价值高温胁迫下各试验种质耐热性用主成分评价所得的耐热性综合评分值D值表示，按公式（3）［9］计算可得。

2 结果与分析

2.1 高温胁迫对百脉根生理生化指标的影响在22℃下，8份百脉根种质相对电导率、MDA、Pro含量以及SOD、POD和CAT活性间均无显著差异，随处理温度的增加，各指标发生了变化，种质间出现差异（图1）。

随处理温度的增加，各百脉根种质的叶片相对电导率和MDA含量明显上升。在35和45℃，种质B04、B08的相对电导率和MDA含量分别最小，在45℃下，B02的相对电导率最大。在35℃高温处理下，种质B02和B18的MDA含量最大，但升到45℃时，B03的MDA含量迅速增加，成为MDA含量最大的种质材料。

在高温胁迫下，各百脉根种质Pro含量均有增大趋势，且随着胁迫温度的上升而明显增加。在45℃处理下，各种质Pro含量均为22℃的7倍以上。此时，种质B08和B05的Pro含量显著高于其他种质（P＜0.05）；种质B03和B18的Pro含量较小，与其他种质差异显著（P＜0.05）。

随处理温度的增加，各百脉根种质SOD酶活性均呈先升高后降低趋势。在35℃下，种质B08和B05的SOD活性显著高于除B04之外的其他种质，B03的活性显著低于除B02之外的其他种质（P＜0.05）。当处理温度升高到45℃时，种质B08的SOD酶活性仍最大，B04次之，B02和B03的SOD酶活性较小，且与其他种质差异显著（P＜0.05）。

随处理温度的增加，各种质的CAT酶活性和POD酶活性（除B01种质外）均呈逐渐升高趋势。在两个高温处理下，种质B08的POD酶活性最高，B04和B05的CAT酶活性最高。

2.2 高温胁迫下百脉根各生理生化指标的相关性分析高温胁迫下，百脉根种质各生理生化指标间均存在不同程度的相关性（表1）。其中相对电导率与MDA含量，CAT活性与Pro含量和POD活性均呈极显著相关（P＜0.01）。Pro含量与相对电导率、MDA含量、POD活性，CAT活性与 MDA含量间均呈显著相关（P＜0.05）。

图1 高温胁迫对百脉根生理生化指标的影响Fig.1 Effects of high temperature stresses on physiological and biochemical index of Lotus corniculatus

表1 高温胁迫下百脉根各生理生化指标的相关性分析Table 1 Correlation analysis of physiological biochemical indexes of Lotus corniculatus under high temperature stress

2.3 生理生化指标的主成分分析经过主成分分析将6个单项指标转换成6个主成分，其中前两个主成分的贡献率分别为57.20%和28.21%，累积贡献率为85.41%（表2）。按累积贡献率≥85%确定主成分个数［11］，选择前两个主成分作为评价百脉根耐热性的综合指标。表2列出了各主成分的特征向量值，以X（1）和X（2）分别代表第1和第2主成分，X1～X6分别表示6个单项生理指标，以各指标的特征向量为系数，可得到两个综合指标与原6项单项指标的线性组合方程。

主成分特征向量越大，各单项指标对综合指标的贡献度越大［10］。百脉根种质耐热性评价第1主成分中CAT活性和MDA含量的特征向量较大，其次是Pro含量和相对电导率；第2主成分中SOD活性的特征向量最大，其次为POD活性。植物受到高温胁迫时，细胞膜系统受到伤害，膜透性增强，相对电导率增加；细胞膜发生膜脂过氧化作用，膜脂过氧化产物MDA含量增加。CAT活性和Pro含量的增加均有利于维持细胞膜的稳定。因此，第1主成分主要反映高温胁迫条件下维持生物膜结构稳定的因子；SOD和POD是细胞内重要的保护酶，因此，第2主成分主要反映高温胁迫条件下生物体内保护酶系统。

2.4 耐热性的综合评价根据主成分表达式及隶属函数公式分别求得百脉根种质的各综合指标值X（i）及其隶属函数值U（x）和综合耐热D值（表3），根据各综合指标的贡献率及累积贡献率，利用公式（2）可分别求出各综合指标的权重。经计算，两个综合指标的权重分别为0.669 7和0.330 3。

耐热性综合评价值（D）值越大表明耐热性越强，反之则越弱。综合3个温度梯度下8个百脉根种质资源的 D值，其大小分别为B01（0.567 6）、B02（0.664 3）、B03（1.129 0）、B04（1.589 1）、B05（1.520 8）、B08（1.757 2）、B12（1.108 8）和 B18（1.416 9）。

3 讨论与结论

高温胁迫已成为影响植物生长发育的主要逆境因素［17］。大量研究表明，高温胁迫下，植物为了抵御高温，体内会发生一系列的生理生化变化，细胞膜透性、MDA含量、Pro含量、SOD酶活性、POD酶活性和CAT酶活性都会发生变化。不同种、甚至不同品种间上述指标的变化情况因植物对高温耐受性的不同而不同，因此，常被用于植物耐热性评价指标［18－20］。本研究中，各百脉根种质随高温胁迫强度的增加，相对电导率和MDA含量上升，Pro含量增加，CAT和POD酶活性（除B01种质外）均呈升高趋势，SOD酶活性呈先升高后降低趋势，表明高温胁迫下，百脉根细胞膜脂中不饱和脂肪酸发生氧化，导致生物膜破坏，膜透性增强，细胞内电解质外渗，相对电导率值增大；MDA是膜脂过氧化最终分解产物，叶片中的MDA含量增加表明细胞膜的脂质过氧化程度增强。游离脯氨酸作为渗透调节物质，在高温胁迫下，各百脉根种质Pro含量增加，起到调节细胞质渗透压、降低植物细胞酸度、稳定细胞大分子结构的作用。SOD、CAT和POD是植物对膜脂过氧化作用的酶促防御体系中的保护酶。其中SOD是植株内活性氧清除的第一道防线，酶系统主要是在SOD酶的作用下将·O2－岐化成H2O2和O2，而CAT和POD酶则进一步将H2O2催化生成H2O，从而减少·O2－和H2O2的积累。

表2 高温胁迫下百脉根各指标的主成分分析Table 2 Principal component analysis of different indexes of Lotus corniculatus under high temperature stress

表3 高温胁迫下百脉根的综合指标值X（i）及其权重、隶属函数值U（x）、综合评价值D及排序Table 3 The values of comprehensive index X（i）and weight，subordinate function value U（x），comprehensive evaluation value D and prediction value of Lotus corniculatus under high temperature stress

相关性分析发现，高温胁迫下百脉根各指标间存在不同程度的相关性，使各指标所提供的信息发生了重叠。如果直接利用这些指标评价百脉根种质的耐热性强弱，难以得到准确的结果，需要应用主成分分析与隶属函数相结合，进行各百脉根种质的耐热性综合评价值，这样既考虑各单项指标间的相互关系，又兼顾各指标的重要性，也避免了人为确定权重的主观性。采用主成分分析法将原来6个彼此相关的指标转换成两个相互独立的综合指标，累积贡献率达85.411%。其中第1主成分特征向量较大的是CAT活性和MDA含量，其次是Pro含量和相对电导率；第2主成分特征向量最大的是SOD活性，其次为POD活性。因此第1主成分主要反映了高温胁迫条件下维持生物膜结构稳定的因子，第2主成分主要反映了高温胁迫条件下生物体保护酶系统。

依据贡献率大小和累积贡献率，确定两个综合指标的权重分别为0.669 7和0.330 3。利用综合指标的隶属函数值和权重，计算出各百脉根种质的耐热性综合评价值。综合推测，各种质耐热性顺序为B08＞B04＞B05＞B18＞B03＞B12＞B02＞B01。百脉根种质B04、B08、B12和B18为贵州本土种质资源，其中B08和B04表现出很强的耐热性，强于市售的南方型品种B05，说明当地本土百脉根种质具有优良的耐热性状，结合正确的育种手段，对其加以培育和选择，有望培育出适应性更强、稳产性更好的新品种。

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