向雨秘 龙少波 朱 勍

(浙江工业大学生物与环境学院，浙江 杭州 310014)

铜元素是生物体内所必需的一种微量重金属元素和必需的营养素，在细胞中的含量仅次于锌和铁，在各种有机体的基本生理过程中发挥着重要作用[1]。铜离子作为生命系统中重要的微量元素，它以作为金属酶（如细胞色素氧化酶、过氧化物歧化酶、酪氨酸酶、多巴胺β-羟化酶、赖氨酰氧化酶和铜蓝蛋白等二十多种酶类）的催化辅助因子的形式，广泛参与了生命体系中电子传递、氧化还原等一系列过程，在生物体内的酶反应、酶转录以及一些氧化还原过程发挥重要的作用[2-3]。铜离子在生物体内的含量很小，但铜缺乏可导致生长和代谢的紊乱，铜离子的含量过多同样也会对生物体产生巨大的毒害作用。体内的铜离子代谢平衡受到破坏会导致神经退行性疾病的发生，例如缅克斯综合症、威尔森氏综合症、家族性肌萎缩症和阿尔茨海默氏症等疾病[4-6]。因此，寻求一种快速灵敏简便的铜离子检测方法在生物研究和医学诊断中具有重要的意义。

目前传统的检测方法主要有原子吸收光谱法[7]、电感耦合等离子体-质谱法[8]、电感耦合等离子体-原子发射光谱法[9]、分光光度测定方法[10]和循环伏安法[11]等检测铜离子的方法。但这些检测方法需要昂贵复杂的检测设备，且检测过程中较为繁琐，不适合大批量检测和实时检测。荧光探针检测方法具有灵敏度高，选择性好，方法简便等优势，并且可通过荧光成像技术对生物体内的铜离子进行观测和实时检测[12,13]。因此，荧光探针检测技术作为一种新型高效简便的检测手段，被广泛的应用于铜离子的检测中。本文通过参考一些最新前沿的相关文献报道，根据铜离子荧光探针的不同作用原理，总结了近几年铜离子荧光探针的研究进展。

1 基于光诱导电子转移过程的荧光探针

在众多铜离子荧光探针中，基于光诱导电子转移(photoinduced electron transfer,PET)机理[14]而设计的荧光分子探针最为常见，而这种探针也常常用于对其他阳离子的检测中。一般情况下，一个典型的PET结构是由识别基团通过间隔基和荧光基团相连而成，PET荧光探针的荧光基团和识别基团之间存在着光诱导电子转移，对荧光有非常强的猝灭作用。

2006年，Zeng等[15]报道了一种高度选择性的Cu+荧光探针，机理见Scheme 1所示。该探针采用硫冠醚结构作为探针的识别基团，而荧光基团则为BODIPY染料。由于PET作用，探针本身的荧光强度十分微弱，当探针的识别基团与Cu+螯合后，PET受到限制，探针的量子产率从之前的0.016增至0.13，发出强烈荧光。实验结果表明，在所有检测的离子 (Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cu+)中，该探针对 Cu+表现出良好的选择性和灵敏性。最后成功的应用于活细胞荧光成像检测，有助于帮助阐释亚铜离子在细胞内的生理学及病理学作用。

2010年，Domaille D W等[16]对此探针进行了改进，将硫冠醚结构连接到BODIPY的5位，合成了一种新型的探针结构。该探针与Cu+螯合后荧光强度随之增加了20倍，并表现出良好的选择性。

Scheme 1

2 基于C-O键断裂过程的荧光探针

基于C-O键断裂作用的荧光探针最为常见。荧光探针分子中的荧光团通过醚键和识别基团连接后荧光淬灭，当与目标作用后醚键断裂，荧光团上的识别基团脱落而发出强荧光。这种荧光探针主要是通过识别基团与荧光团之间的醚键断裂而检测，因此，该探针也常常用于酶活性的检测中。2010年，Taki M等[17]合成了一种以荧光素为荧光基团的的荧光探针（Scheme 2），这种新型的荧光探针和铜离子作用后发生水解，荧光素上的识别基团脱落，随后产生强荧光的荧光素。通过对 Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cu+等离子的检测，该探针表现出极好的选择性和极高的灵敏性，并成功的用于细胞荧光成像检测。该探针设计简便，灵敏度高且容易操作，因而被广泛应用于铜离子的检测。

Scheme 2

3 基于胺及酰胺配位作用的荧光探针

由于胺中N原子上具有孤对电子，它可以和Cu2+的空轨道发生配位，因此利用配位作用可以用来识别铜离子，常用来作为Cu2+的识别基团有胺和酰胺基团。近年来，罗丹明的内酰胺螺旋结构已成为了研究热点[18]：罗丹明B处于内酰胺螺环状时并无荧光，当内酰胺螺环状结构受到破坏而开环时会产生玫瑰色和强荧光。这种独特的开环识别的机理已被广泛的用于制备荧光增强型Cu2+荧光分子探针。

1997年，Czarinik等[19]首次利用该机理设计和合成了罗丹明B酰肼探针（Scheme 3），该探针可以选择性识别铜离子，其原理是基于铜离子催化罗丹明B酰肼水解生成强荧光的罗丹明B分子。

Scheme3

2012年，Kumar M等[20]巧妙的对该探针进行了改进，将具有荧光的酰肼衍生物替代酰肼，设计和合成了一种新型的铜离子荧光探针。机理见Scheme 4。该探针与铜离子作用后，罗丹明B酰肼结构发生水解，生成了强荧光的罗丹明B分子以及强荧光的酰肼衍生物（HZD）。因此，该探针可以测定双发射波长的荧光信号，更能精确的检测铜离子的浓度变化。并且该探针成功地用于细胞荧光成像检测，为进一步在分子水平上对铜离子的的研究奠定了基础。

Scheme 4

4 基于FRET作用的荧光探针

荧光共振能量转移 (fluorescence resonance energy transfer，FRET)[21]是激发态时能量供体与受体通过远程偶极-偶极耦合作用，发生的非辐射能量转移过程。荧光共振能量转移的效率与供受体荧光团之间的距离有着十分重要的关系，因此，任何改变两个荧光团的距离和方向都能影响着的FRET效率。相比于单信号的荧光探针，FRET荧光探针能够实现更大的stoke位移，减少背景信号的干扰；通过检测双波长的发射光谱，能够实现比率检测，削弱其他因素的干扰，极大地提高了探针的灵敏性。

2012年，Lin Yuan等[22]根据罗丹明B酰肼与铜离子的配位作用机理设计了一种新型的FRET荧光探针（Scheme 5）。当环境中不存在铜离子时，由于探针中罗丹明B酰胺处于闭合状态，此时从香豆素到罗丹明B的FRET是被阻止的，只能检测到供体的发射波长。当环境中存在铜离子时，探针的内酰胺结构打开，FRET开启，能量发生了转移，此时用410 nm波长的光激发，可以检测到581 nm的主峰和473 nm的小峰，分别对应着罗丹明B基团和香豆素基团的最大发射波长，把581 nm和473 nm的荧光强度的比值作为检测值，随着铜离子的浓度增大，比值也相应的增加。这种比率检测方法能够极大降低检测环境中背景的干扰，提高了探针的灵敏度。通过对Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cu+、Ag+、Cd2+、Cr3+、Hg2+、Pb2+、Al3+、Sn2+等离子的检测，探针对Cu2+表现出极好的选择性和极高的灵敏性。

Scheme 5

Lee等[23]设计了双供体 FRET荧光探针（Scheme 6），该探针以连接两个丹磺酰荧光染料作为双供体，极大的提高了该探针的灵敏度和准确性。

2010年，Wegner S V等[24]在酵母细胞内通过基因编码表达构建了一个Amt1-FRET铜离子荧光探针。该探针由青色荧光蛋白（CFP）通过类金属硫蛋白的多肽(Amt1)和和黄色荧光蛋白（YFP）连接而成。它主要通过Amt1上的巯基与铜离子发生络合作用后改变其空间构象，使得两个荧光基团相互靠近，能量发生了转移，从而达到检测的目的。该探针是由基因编码表达而成的，减少了有机染料给细胞带来的毒害作用，提高了探针的灵敏度。它在酵母细胞中对铜离子检测的良好表现也为在哺乳动物細胞內对铜离子进行动态研究提供了可能。

Scheme 6

5 基于核磁共振技术的双功能探针

核磁共振成像（MRI）检测[25]是最近新兴发展的一种新的检测技术，相比于荧光探针检测技术，具有更高的空间分辨率和对比度，且可同时获得三维解剖结构及生理信息等优势，因此，MRI探针也常常用于对铜离子的检测中。2012年，Zhang等[26]将一萘衍生物荧光基团连接在Gd3+-DO3A核心结构上，设计和合成了一个双功能探针 （Scheme 7）。当环境中没有铜离子时，Gd3+-DO3A核心结构由于萘衍生物导致的空间位阻使环境中的水未能进入，降低了其纵向弛豫值。当探针与铜离子结合后，萘衍生物受体与铜离子形成螯合结构，减少了对Gd3+-DO3A的阻塞作用，使得环境中的水能够进入里面，提高了探针的纵向弛豫值，发出明显的核磁共振信号，而萘衍生物荧光基团由于铜离子的螯合作用荧光发生淬灭。该探针采用了双信号检测，既然检测MR信号，又能检测荧光信号变化，提高了探针的灵敏度和准确性。

Scheme 7

6 展望

本文综述了各种类型的铜离子荧光探针，总结了大多数铜离子荧光探针的设计原理和应用。随着对铜离子研究的不断深入，荧光探针在生物及医学领域中越来越发挥其重要的作用。相信，通过不断的努力，最终会开发一种更高效、更灵敏、简单方便的探针，在生物学研究、环境监测、临床医学以及疾病诊断等领域方面发挥着重要的作用。

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