许 运，陈 亮，史 勇，顾 勇，邹 俊，唐天驷

（1.苏州市相城人民医院骨科，江苏苏州215131；2.苏州大学附属第一医院骨科，江苏苏州215006）

骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSC）具有多向分化潜能以及自我更新能力，是细胞移植治疗椎间盘退变中最有前景的种子细胞。但是，如何诱导MSC向髓核样细胞分化而发挥其修复作用还存在一定的争议。SOX9基因是调控MSC向软骨类细胞分化的一个关键因子［1－3］，SOX9基因不仅能维持软骨细胞表型，还能增加Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖（Aggrecan）基因的表达水平［4－5］。本研究通过构建SOX9慢病毒载体并感染兔MSC，旨在诱导其向髓核样细胞分化，为探索椎间盘退变的生物学治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 主要试剂：限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ购自日本TaKaRa公司；包装细胞T4连接酶、KODPlus高保真酶购自日本TOYOBO公司；RNA抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自美国Axygen公司；高效克隆E.coli DH5感受态细胞购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司；Trizol、胎牛血清、胰蛋白酶购自上海生工生物工程有限公司；抗CD44、CD29抗体购自美国 Millipore公司；抗CD45、CD34抗体购自美国Santa Cruz公司；抗SOX9、Ⅱ型胶原、Aggrecan抗体和异硫氰酸荧光素山羊抗兔IgG购自Abcam公司。慢病毒载体由苏州大学附属第一医院骨科实验室构建。慢病毒载体系统是由质粒pRsv－REV、pMDlg－pRRE、pMD2G及Pwpxl－MOD2组成的第3代慢病毒载体，其中载体质粒Pwpxl－MOD2能表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）。主要仪器：倒置显微镜（日本Olympus公司）、电泳仪（美国Bio－Rad公司）、垂直板电泳装置（美国Bio－Rad公司）、Chemidox化学发光成像仪（美国Bio－Rad公司）、荧光显微镜（日本Olympus公司）、PCR仪（美国PE公司）、凝胶成象系统（美国Alpha Innotech公司）。……