李季文

(甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050)

胡蓝降糖缓释片质量标准研究△

李季文*

(甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050)

目的：建立胡蓝降糖缓释片的质量控制标准。方法：采用薄层色谱法对胡蓝降糖缓释片中绞股蓝进行定性鉴别，用高效液相色谱法对胡芦巴中薯蓣皂苷元进行含量测定。结果：本品定性鉴别薄层色谱特征明显，专属性强。采用迪马SEDEX75-蒸发光散射检测器，岛津VP-ODS色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，甲醇-水(84∶16)为流动相；检测波长203 nm；流量1.0 mL·min-1；柱温40 ℃；漂移管温度85 ℃；气流体积流量2.5 L·min-1。塔板数以薯蓣皂苷元计，不低于2 000。薯蓣皂苷元在0.842～8.42 μg与其色谱峰面积呈良好线性关系，薯蓣皂苷元平均回收率为98.53%，胡蓝降糖缓释片在2，4，12 h的释放量分别在18%～35%，35%～55%，80%以上，均符合规定。结论：该法简便、准确、专属性强，可作为胡蓝降糖缓释片的质量控制方法。

胡蓝降糖缓释片；质量控制；薯蓣皂苷元

胡蓝降糖缓释片系由胡芦巴、绞股蓝2味中药组成的片剂，具有益气养阴的功能，用于治疗消渴病。方中胡芦巴为豆科植物Trigonellafoenum-graecumL.的干燥成熟种子。味苦，性温，具有温肾助阳，祛寒止痛的功能。用于肾阳不足，下元虚冷，小腹冷痛，寒疝腹痛，寒湿脚气[1]。研究证明胡芦巴各种形式加工物对糖尿病大鼠均有较明显的降糖作用[2]。绞股蓝Gynostemmapentaphyllum(Thunb.)Makino系葫芦科(Cucurbitaceae)绞股蓝属(Gynostemm)多年生草质藤本植物[3]。《中药大辞典》中名为七叶胆，别名小苦药、遍地生根、五叶参，日本名为甘茶蔓[4]。具有滋补强身，消除疲劳，降脂降压，防癌抗癌，延年益寿等功能。现代药理学证明绞股蓝具有显著降血脂、降血糖、平衡血压、抗癌、抗衰老、保护肝脏、提高免疫功能等药理作用[5-7]。在胡蓝降糖缓释片工艺研究的基础上，建立了制剂中绞股蓝的薄层色谱定性鉴别方法及薯蓣皂苷元的高效液相测定方法，从而使该产品的质量标准进一步得到完善和提高。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AB型高效液相色仪，SIL-20AC自动进样器，CTO-20AC柱温箱，CBM-20A控制器，DGU-20A3脱气机，迪马SEDEX75-蒸发光散射检测器，LC solution色谱工作站(日本岛津)；BS110电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)；80-1型离心机(北京机械仪器维修厂)；R-200旋转蒸发仪(瑞士布奇)；微波干燥仪(天水华圆制药设备有限公司)；HH-601恒温水浴锅(金坛市恒丰仪器厂)。

1.2 试药

胡芦巴、绞股蓝购自甘肃省黄河药材市场，经甘肃中医学院附属医院杨锡仓主任中药师鉴定为正品，胡蓝降糖缓释片(自制，批号：20101001，20101002，20101003)，薯蓣皂苷元对照品(中国食品药品检定研究院，含量测定用，批号：110648-200708)，人参皂苷Rg1对照品(中国食品药品检定研究院，鉴别用，批号：110703-200304)，甲醇为色谱纯(山东省禹王实业有限公司)，三氯甲烷为分析纯(烟台市双双化工有限公司)，其他试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

2 方法

2.1 绞股蓝薄层色谱鉴别

取本品15片，除去薄膜衣，研细，置索氏提取器中，加乙醚70 mL，加热回流提取2 h，弃去乙醚液，取出滤纸筒，晾干。置索氏提取器中，再加甲醇70 mL，加热回流提取至无色，回收甲醇并浓缩至干。残渣加水30 mL溶解，滤过，滤液用水饱和的正丁醇提取5次(25，20，10，10，10 mL)，合并正丁醇液，用氨试液洗涤3次，每次20 mL，弃去氨试液，正丁醇液再用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次20 mL，弃去水洗涤液，正丁醇液回收至干，残渣加甲醇5 mL溶解，作为供试品溶液。另取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。取处方药品，按优选的制备工艺制备缺绞股蓝的缓释片，按供试品溶液制备阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(65∶35∶10)10 ℃以下放置12 h的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。薄层色谱图见图1。

1.人参皂苷Rg1 2～5.供试品，6.阴性对照图1 绞股蓝薄层色谱图

2.2 薯蓣皂苷元的含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 SEDEX75-蒸发光散射检测器，岛津VP-ODS色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；甲醇-水(84∶16)为流动相；检测波长203 nm；流量1.0 mL·min-1；柱温40 ℃；漂移管温度85 ℃；气流体积流量2.5 L·min-1。塔板数以薯蓣皂苷元计不低于2 000。进样量为20 μL进行含量测定。

2.2.2 溶液制备

2.2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取薯蓣皂苷元对照品5.46 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2.2 供试品溶液的制备 取本品10片，除去薄膜衣，研细，称取0.5 g，精密称定，加3 moL·L-1盐酸溶液20 mL，水浴中加热水解30 min。取出，放冷，加入三氯甲烷30 mL，加热回流15 min，用三氯甲烷30 mL，同法处理1次，滤过，再用三氯甲烷30 mL洗涤容器及残渣，合并三氯甲烷液，回收三氯甲烷至干，残渣加甲醇溶解并转移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2.3 阴性对照溶液的制备 按处方量称取绞股蓝，依胡蓝降糖缓释片制备工艺制成缺胡芦巴阴性样品，再按2.2.2.2项下的方法制备缓释片阴性对照溶液。

2.2.3 专属性试验 取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液分别进样，在薯蓣皂苷元相同出峰时间处，阴性对照溶液色谱不出峰，表明阴性对照不干扰本品测定。结果见图2。

A.薯蓣皂苷元对照品 B.胡蓝降糖缓释片供试品C.缺胡芦巴阴性样品图2 胡蓝降糖缓释片及对照品HPLC图

2.2.4 线性关系考察 精密称取薯蓣皂苷元对照品，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即为对照品储备液(4.21 mg·mL-1)。精密吸取此储备液5 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。精密吸取1，2，4，6，8，10 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积。以对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归。回归方程Y=812 991.42X+1 252 792.92，r=0.999 6。结果薯蓣皂苷元在0.842～8.42 μg与其色谱峰面积呈良好线性关系。

2.2.5 精密度试验 精密吸取薯蓣皂苷元对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，连续进样5次，测得薯蓣皂苷元峰面积积分值，RSD=1.41%。

2.2.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别在0，2，4，8，12 h注入液相色谱仪中，测定薯蓣皂苷元峰面积，计算RSD=2.13%。结果表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.2.7 重复性试验 取同一批胡蓝降糖缓释片粉末6份，平行制备供试品溶液，各取20 μL进样测定，计算RSD=1.93%(n=6)，表明方法的重复性较好。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的胡蓝降糖缓释片粉末(过四号筛)，精密称取6份，分别精密加入薯蓣皂苷元对照品溶液0.3 mL，按上述方法测定含量并计算加样回收率，结果见表1。

表1 薯蓣皂苷元加样回收率试验

注：薯蓣皂苷元对照品加入量均为1.21 mg

2.2.9 样品含量测定 取3批胡蓝降糖缓释片(批号：20101001，20101002，20101003)，研细，按2.2.2.2项下方法制备供试液，精密吸取20 μL，注入液相色谱仪，测定薯蓣皂苷元含量分别为0.47，0.51，0.43 mg·g-1。

2.3 体外释放度评价[8-11]

取缓释片6片，照释放度测定法(《中国药典》2010年版二部附录XD第一法)，采用溶出度测定装置，以蒸馏水1 000 mL为溶出介质，转速为100 r·min-1，依法操作，经1，2，4，6，8，10，12 h取溶液5 mL，滤过，并即时在操作容器中补充水溶液5 mL，取续滤液，精密量取5 mL，水浴蒸干，残渣加3 moL·L-1盐酸溶液20 mL(10，5，5 mL)溶解，依次转移至锥形瓶中，水浴中加热水解30 min。取出，放冷，加入三氯甲烷30 mL，加热回流15 min，用三氯甲烷30 mL，同法处理1次，滤过，再用三氯甲烷30 mL洗涤容器及残渣，合并三氯甲烷液，回收三氯甲烷至干，残渣加甲醇溶解并转移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。供试品与对照品溶液照高效液相色谱法，在203 nm波长处分别测定，计算出不同时间的累积释放度。结果见表3。

表3 不同时间薯蓣皂苷元累计释放度

由表3可知，本品每片在2，4，12 h的释放量应分别为18%～35%，35%～55%，80%以上，均符合规定。

3 讨论

3.1 溶出介质和测定指标的选择

按照释放度测定法(《中国药典》2010年版二部附录X D)和缓控释制剂试验指导原则(《中国药典》2010年版二部附录XIX D)，考察水、pH 6.8的磷酸盐缓冲液、盐酸溶液(0.1 moL·L-1)对薯蓣皂苷元释放度的影响。结果表明水、pH 6.8的磷酸盐缓冲液、盐酸溶液(0.1 moL·L-1)对薯蓣皂苷元的释放度无显著影响。因此，选择水作为溶出介质。

3.2释放度测定方法的确定

胡蓝降糖缓释片的凝胶骨架材料易吸水膨胀并产生较大的黏性，易粘于杯底，故采用转篮法进行测定。用体外释放度测定方法(转篮法)，转速(100±l)r·min-1，温度(37±0.5) ℃，蒸馏水1 000 mL为释放介质，于不同时间点取液5 mL(取液后立即补加5 mL溶出介质)，微孔滤膜过滤，备用。

3.3 测定波长和辅料干扰试验

取药粉和辅料，分别在390～190 nm波长扫描。结果在203 nm处药粉有最大吸收，辅料无吸收，表明辅料对测定方法无干扰。

3.4 取样时间点及释放量的确定

根据《中国药典》2010年版二部缓控释制剂指导原则关于取样时间点的规定(第一点0.5～2 h累积释放率约30%，第二点为中间点的累积释放率约50%，最后的取样点累积释放率为75%)，选择取样时间点为2，4，12 h释放量分别为18%～35%，35%～55%，80%以上。

3.5 方法评价

实验建立了制剂中绞股蓝的薄层色谱鉴别方法，以薯蓣皂苷元含量为评价指标，采用高效液相色谱法SEDEX75-蒸发光散射检测器，建立胡蓝降糖缓释片的含量测定方法，同时测定了缓释片的体外释放度，实验研究结果表明，薄层鉴别及液相色谱方法均简便、准确、可靠，可用于控制该制剂的质量。

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[2] 安福丽，张仲，陈贵银，等.中药胡芦巴的药理作用研究进展[J].中国药业，2010，19(4)：63.

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[8] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：8.

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[10] 国家药典委员会.中国药典[S].二部.北京：中国医药科技出版社，2010：附录87.

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StudyonQualityStandardsforHuLanHypoglycemicSustainedReleaseTablets

LI Ji-wen*

(GansuProvinceHospitalofCM，Lanzhou730050，China)

Objective：To establish Hu Lan Hypoglycemic Sustained Release Tablets quality control standard.Methods：TLC qualitative identification method was used to gynostemma in Hu Lan Hypoglycemic Sustained Release Tablets.Using HPLC method for diosgeni determination.Results：This product has apparent feature and strong specificity in qualitative identification of thin layer chromatography.The Dimma SEDEX75-evaporative light scattering detector，island sea VP-ODS (150 mm×4.6 mm，5 μ m)chromatographic column，methanol and water (84∶16)as mobile phase；Detection wavelength is 203 nm，flow rate 1.0 mL·min-1，column temperature 40 ℃；drift tube temperature 85 ℃；airflow volume flow 2.5 L·min-1.Plate hundreds of diosgeni meter，no less than 2 000.Diosgeni in 0.842-8.42 μg range and its chromatographic peak area had good linear relationship，and the average recovery of diosgeni was 98.53%，each piece in 2，4，12 h release quantity respectively in 18%-35%，35%-55%，80% range，which conform to the provisions.Conclusion：The method is simple，accurate，strong specificity and can be used as Hu Lan Hypoglycemic Sustained Release Tablets quality control method.

Hu lan Hypoglycemic SustainedvRelease Tablets；Quality Standards；Diosgeni

2013-02-26)

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甘肃省科技支撑计划(090NKCA103)

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李季文，主要研究方向：中药制剂研究开发，E-mail：ljwlzh888@163.com