黄必胜，袁明洋，余驰，陈科力*

(1.湖北中医药大学&教育部中药资源和中药复方重点实验室，湖北 武汉 430065； 2.仙桃市药品检验所，湖北 仙桃 433000)

红外及近红外光谱法对真伪龙齿的快速鉴别△

黄必胜1，袁明洋1，余驰2，陈科力1*

(1.湖北中医药大学&教育部中药资源和中药复方重点实验室，湖北 武汉 430065； 2.仙桃市药品检验所，湖北 仙桃 433000)

目的：建立近红外光谱对真伪龙齿的快速识别方法。方法：采用近红外光谱法对真伪龙齿进行化学成分分析，在此基础上探索建立近红外光谱聚类分析模型，并验证模型的准确性。结果：在红外光谱区真伪龙齿都有其特征吸收峰，且伪品龙齿具有更多的峰信息；在此基础上成功建立了近红外光谱聚类分析模型。结论：红外光谱法可以作为验证龙齿化学成分的一种方法，而利用近红外光谱法建立相应的模型可以快速准确地鉴别真伪龙齿。

龙齿；红外光谱；近红光谱法；聚类分析

中药龙齿为古代哺乳动物牙齿的化石，随着其资源的日益减少和价格的提高，其混伪品也日渐增多。如：将牛或其他哺乳动物的牙齿经石灰窖埋后，再打碎成细小碎块或粉末后充“白龙齿”出售[1]。其外观性状与正品大致相同，外观类似，不易区别，而以性状鉴别为基础的经验鉴别因主观性较强很难快速准确鉴别其真伪，因此探索采用中红外光谱对真伪龙齿进行鉴别。近年来，利用近红外光谱法鉴别中药材真伪的研究越来越多[2-6]，而对中药龙齿真伪鉴别尚无。笔者尝试利用近红光谱法对真伪龙齿进行快速分析研究，并建立相应的定性模型，所建立的聚类分析模型可以快速鉴别真伪龙齿。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Spectrum 400傅立叶变换红外光谱仪，测定范围：4 000～400 cm-1，车载近红外光谱仪(MATRIX-F型，外接1.5 m固体光纤探头)，OPUS工作站。

1.2 材料

23批样品分别采自于湖北中医药大学标本馆、安徽亳州中药材市场、河北安国中药材市场、河南禹州中药材市场、湖南廉桥中药材市场以及湖南花板桥中药材市场。每批样品均经过湖北中医药大学生药学教研室陈科力教授鉴定。

溴化钾(KBr)(AR，国药集团化学试剂有限公司)。

2 方法与结果

2.1 中红外光谱分析

取龙齿原药材洗净，晾干，砸成小块，粉碎过200目筛备用。分别将样品粉末和磨细的溴化钾按1∶100的比例在玛瑙研钵中混合均匀，在手动压片机上制成透明薄片进行测试。测定区域4 000～400 cm-1，扫描次数16次，分辨率4 cm-1，数据处理图谱经计算机自动基线校正和自动纵坐标标准化处理。对比真伪龙齿的红外吸收图谱，如图1，发现二者有相似之处。由于龙齿的主要成分为碳酸钙和磷酸钙[7]，从其红外吸收光谱可以观察到磷酸钙的特征吸收峰1 033，957，602，565，470 cm-1，其中1 033 cm-1为PO42-反对称伸缩振动，957 cm-1为PO42-对称伸缩振动，602、565 cm-1为PO42-不对称变角振动，470 cm-1为PO42-对称变角振动。CO32-的4个原子处于同一平面内，3个氧原子在正三角形的3个顶点。CO32-有4种振动模式，分别是反对称伸缩振动、对称伸缩振动、面外弯曲振动、面内弯曲振动。CO32-所对应的红外吸收峰位置分别处于以下4个窄带之内：1 510～1 390 cm-1，1 120～1 045 cm-1，885～820 cm-1，775～680 cm-1。图1中对应的CO32-吸收峰为1 452，1 423，1 033，863，711 cm-1，其中CO32-反对称伸缩振动对应1 452，1 423 cm-1双峰，1 033 cm-1本该为弱峰，该处有PO42-反对称伸缩振动的贡献，故为强峰。3 443 cm-1处为O-H伸缩振动吸收峰，因龙齿中还含有甘氨酸、胱氨酸、蛋氨酸等7种氨基酸[8]；1 636 cm-1可能为酰胺基中的羰基吸收峰。

从峰位上看，图1所示的真伪龙齿红外光谱在峰数和形状上几乎一致，但在820～660 cm-1区域二者的图谱存在着微小差异，伪品龙齿含有更多的峰信号。结果表明：在红外光谱吸收范围内，伪品龙齿较正品龙齿含有更多的物质信息。

图1 真伪龙齿红外光谱图

2.2 近红外光谱分析

2.2.1 近红外光谱的采集 所采集的样品多来源于国内流通量较大的中药材专业市场内主营矿物类药材店面，样品具有一定的地域代表性。对龙齿药材样品进行光谱采集前应该仔细观察采集面的物理特征，排除样品表面可能混有其他无机杂质部位，以免影响样品蕴含的真实光谱信息；其次，龙齿药材外部棱角分明，在进行近红外扫描时，应选择平整部分，使光纤探头与样品贴合紧密，减少光的散射；另外，样品内的化学成分分布可能不一致，采集光谱时应分次对药材的各个面进行扫描，保证样品数据的完整性。同时将药材粉碎，混合均匀后，对其粉末进行光谱采集。

光谱采集参数：扫描波数间隔为8 cm-1，扫描累积32次，扫描区间为12 000～4 000 cm-1，InGaAs检测器，光纤传导。每份药材样品各面扫描共10次，药材粉末重复扫描10次。龙齿原药材及药材粉末近红外图谱见图2。

图2 龙齿原药材及粉末近红外光谱图

由图2可以看出，龙齿药材粉末的10张近红外光谱重合在一起，光谱之间的差异性很小；而龙齿原药材不同部位扫描得到的10张近红外光谱各有差异，各个光谱不仅在吸光度上有差别，在峰形上也千差万别。因此将原药材不同面采集的图谱与原药材粉末的图谱结合起来共同建立定性模型，既增大了药材的信息量，又加强了模型的适用性。

2.2.2 真伪龙齿近红外光谱聚类分析定性模型的建立 从23批次样品中随机挑选11批样品，编号为LQ-004号样品药材采集光谱后，将其粉碎制成编号为LQ-004-1号样品，故训练集样品共12批次，其余12批次为验证集样品。训练集样品信息见表1，验证集样品信息见表2。

表1 真伪龙齿训练集样品信息

表2 真伪龙齿验证集样品信息

对上述样品的光谱图进行仔细观察，发现所有样品的近红外光谱整体上较为相似，经过一阶导数处理后，光谱差异变得明显，样品的近红外漫反射原始光谱和一阶导数光谱见图3。

图3 真伪龙齿的近红外原始光谱及一阶导数光谱

从样品原始图谱可以观察到龙齿及其伪品在9 000～8 000 cm-1，7 000～5 600 cm-1，4 800～4 000 cm-13个波长区域内光谱信号稍有不同，光谱经过一阶导数处理后，上述区域光谱差异更加明显。由于建模样品涉及到原药材(块状)与药材粉末，样品的径粒对近红外光谱具有明显的影响[9]，而矢量归一化法可以消除径粒对光谱的影响，因此采用矢量归一化方法对图谱进行预处理是必要的。OPUS软件可以对图谱进行预处理，通过考察一阶导数、一阶导数+矢量归一化、二阶导数、二阶导数+矢量归一化4种预处理方法进行聚类分析，发现利用一阶导数和一阶导数+矢量归一化预处理图谱进行聚类分析可以准确将真伪龙齿区别开。为了增加模型的适用性，消除样品径粒对光谱的影响，我们选择预处理方法为：一阶导数+矢量归一化。预处理方法中还包含有平滑点数的选择，平滑可以消除误差、改进数据，在本模型中选择5、9、13点平滑均未对聚类分析结果产生影响，但是平滑点数过多，会使数据失真，所以选择9点平滑。波段范围：9 000～8 000 cm-1，7 000～5 600 cm-1，4 800～4 000 cm-1，采用Ward’s algorithm(标准算法)计算，真伪龙齿聚类分析图见图4。

由图4可以看出，龙齿真品和伪品各聚为一类。在树状图的左支(A)中，LQ-004-1、AG-017、YZ-022、AG-023、HBQ-002和BZD-002号样品各自的10张光谱最先聚为一类，而其他6批样品各自的10张光谱聚类较分散，说明龙齿药材不同部位的化学成分可能有一定差异，药材表面物理性质的差异也会对光谱产生影响；而药材粉碎成粉末后，其化学成分分布较均匀，故光谱的距离较小。另外LQ-004号样品的10张光谱与其他正品样品聚类，而与LQ-004-1号样品聚类的仅有1张光谱，提示药材经过粉碎后其光谱会较原药材发生变化，可能是径粒等物理因素的影响或者是原药材中的化学成分重新分布。在树状图的右支(B)，LQ-006、BZC-043和ZY-035的图谱在各小分支中聚集比较紧密，说明实验的3批龙齿药材伪品的化学成分较为接近，可能为同一种掺伪方式。从上述聚类分析图谱可以明显观察到真伪龙齿之间的区别，因此利用近红外聚类分析法可以快速准确地鉴别真伪龙齿。

2.2.3 模型的验证 将验证集的11批样品110张光谱带入到已建好的真伪龙齿定性模型中，对所有图谱的正确识别率为72%，假阳性率为19%，如果以每一批样品中的10张图谱中的6张或以上被正确识别，则认为对这一批样品鉴别正确，那模型的识别率为82%。通过对上述模型的验证，我们建立的龙齿近红外定性鉴别模型基本能快速准确地鉴别真伪龙齿。

3 讨论

龙齿为古代哺乳动物牙齿的化石，它们早期最原始的形态是动物的牙齿，牙齿因为有机质较少，无机质较多，故能保存较长的时间。牙齿被泥沙掩埋后地下水将过剩的矿物质沉淀下来或成为晶体，随着水流会逐渐渗进泥沙中，填补牙齿有机质腐烂后留下的空间，天长日久，原来的牙齿变成了还保存牙齿原有外形和内部结构的石头。而从国内大型专业中药材市场采集的龙齿伪品，经陈科力教授鉴定为大型动物的牙齿，经酸腐蚀和土埋处理后，作为龙齿销售。因此用中红外光谱法分析真伪龙齿时，龙齿伪品含有较多的峰信息，可能为大型动物牙齿中少量的有机物特征信息。

在聚类分析模型中，发现各批龙齿原药材的10张近红外光谱在小类上相互聚集，药材粉末的10张光谱都能紧紧地聚在一起。同一批龙齿的原药材光谱只有部分光谱与其粉末的10张光谱聚为一类，可能的原因在于龙齿原药材表面的化学成分分布不均匀。如：龙齿表面的珐琅质和龙齿横断面，在同一药材不同面采集的10张近红外光谱分别包含着相同或不同的化学信息，因此影响了模型的正确率。另外，各批次间的龙齿正品或龙齿伪品的化学信息也会有所不同，这也可能影响近红外聚类分析模型的正确率。

近红外光谱技术具有快速、无损分析的特点，实验利用近红外光谱聚类分析法对真伪龙齿定性鉴别，结果表明从龙齿药材各部位采集的光谱信息有所差异，药材粉末光谱信息重复性较好，利用近红外光谱聚类分析法可以快速准确鉴别龙齿真伪品。

实验中用于建立近红外定性模型的样品数量有限，不能涵盖所有真伪龙齿的信息，这对模型的适用性有一定的影响，采集到一定数量的样品后，可以利用近红外光谱技术建立相应的定性模型，达到快速准确鉴别的目的。

[1] 陈照荣，来平凡.发现一种新的龙齿伪品[J].浙江中医学院学报，2000，24(5)：77.

[2] 高鸿彬，刘浩，相秉仁.半夏及其伪品天南星的近红外漫反射快速无损鉴别[J].光谱实验室，2012，29(2)：899-902.

[3] 张治军，饶伟文.三七及其伪品的近红外光谱鉴别法[J].中国药房，2009，20(30)：2367-2369.

[4] 余驰，巩晓宇.近红外光谱法建立防己药材的定性模型[J].中国药事，2010，24(7)：679-680.

[5] 余驰，姜红，刘爱萍.近红外漫反射光谱法建立厚朴药材的定性模型[J].药物分析，2009，29(4)：656-658.

[6] 刘荔荔，邢旺兴，贾暖，等.近红外漫反射光谱聚类分析用于中药红曲的鉴别[J].第二军医大学学报，2002，23(11)：1230-1232.

[7] 康廷国.中药鉴定学[M].北京：中国中医药出版社，2008：560.

[8] 张保国.矿物药[M].北京：中国医药科技出版社，2005：22.

[9] 胡昌勤，冯艳春.近红外光谱法快速分析药品[M].北京：化学工业出版社，2010：135.

IRSpectroscopicandNear-infraredSpectroscopicMethodforRapidIdentificationofDensDraconisanditsCounterfeit

HUANG Bi-sheng1，YUAN Ming-yang1，YU Chi2，CHEN Ke-li1*

(1.KeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicineResourceandCompoundPrescription，HubeiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Wuhan430065,China；2.TheXiantaoInstituteforDrugControl，Xiantao433000,China)

Objective：To establish a rapid near-infrared spectroscopy identification method for Dens Draconis and its adulterants.Methods：Analyzed the Chemical composition of Dens Draconis and its adulterant by IR，established near-infrared spectral clustering analysis model.The accuracy of the model was verified.Results：Dens Draconis and its adulterant had different characteristic absorption peaks in the infrared spectral region，and the adulterants had more peaks information.On this basis，the near-infrared spectral clustering model was established successfully.Conclusion：IR is suitable to verify chemical composition of Dens Draconis.Dens Draconis and its adulterants could be quickly and accurately identified by the near-infrared spectral clustering analysis model.

Dens Draconis；IR spectroscopy；Near-infrared spectroscopy；Clustering analysis

2013-04-18)

武汉市2012年高新技术产业发展行动计划——生物技术与新医药专项(201260523193)

*

陈科力，教授，研究方向：中药资源及其品质研究;E-mail：kelichen@126.com