舒 刚，黄 春，杨 乐，张 伟，符华林

（四川农业大学动物医学院，四川 雅安625014）

葛根芩连制剂来源于《伤寒论》中葛根黄芩黄连汤［1］：葛根半斤，炙甘草二两，黄芩三两，黄连三两，上四味，以水八升一，先煮葛根减二升，内诸药，煮取二升，去淬，分温再服。葛根芩连汤是《伤寒论》中治疗湿热证的经典方剂，具有解表清里，升清止痢之功效［2］。葛根芩连汤是在兽医临床治疗湿热下痢、细菌腹泻等大肠湿热证的常用中药制剂，其有效成分确切、疗效明显，应用成熟。目前，葛根芩连汤在人用药领域已经被制备成为多种剂型，如供口服的片剂、配方颗粒、滴丸、微丸及通过其他途径给药的巴布剂和结肠定位释药柱塞胶囊等［3］。但在兽药领域，除了传统的汤剂和散剂外，很少有其他剂型的报道。为了开发临床疗效更为确实的葛根芩连复方制剂，本文从葛根芩连注射剂制备的提取工艺开展研究，采用正交试验法［4］，以提取液澄明度和葛根素、黄芩苷、盐酸小檗碱的含量作为考察指标，对葛根芩连汤的提取方法进行考察，筛选出最佳提取工艺，以丰富葛根芩连的制剂研究内容，为兽医临床提供新型的葛根芩连制剂奠定基础。

1 仪器与试药

1．1 仪器 UV21012P型紫外分光光度计（尤尼可（上海）仪器有限公司）；HS－120D超声波清洗机（上海新芝生物技术研究所）；Elix／RiOs纯水系统（法国密理博中国有限公司）；电子天平（Sartorius，BS110S）；冷冻离心机（美国科峻仪器公司）；PHS－25型酸度计（成都方舟科技开发公司）；HJ－4多头磁力加热搅拌器（常州国华电器有限公司）

1．2 药材及试剂 葛根（Puerariathomsonii Benth）；黄芩（ScutellariabaicalensisGeorgi）；黄连（CoptischinensisFranch）；甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch）（以上药材均购自四川雅安市三九中药材公司）；葛根素（110752－200511），黄芩苷（110715－200815），盐酸小檗碱（110713－200515）（均购自中国药品生物制品检定所）。

2 试验方法

2．1 葛根、黄芩、黄连有效成分含量测定方法的建立 葛根、黄芩、黄连中有效成分分别为葛根素、黄芩苷、盐酸小檗碱。其含量采用紫外分光光度法［5－6］测定。

2．1．1 标准品溶液的制备 精密称取各标准品适量，用75%乙醇完全溶解于25mL容量瓶中，摇匀，备用。

2．1．2 紫外最大吸收波长的确立 取各标准溶液，以75%乙醇为空白，在200～400nm范围内扫描。2．1．3 标准曲线的制备 分别精密移取各标准品溶液1．0、2．0、3．0、4．0、5．0mL至25mL容量瓶中，用75%乙醇配制刻度，在相应波长下以吸光度A对浓度C（mg／mL）绘制标准曲线，并计算回归方程。

2．1．4 精密度试验 仪器精密度：精密吸取各标准品溶液5份，在相应波长下测定吸光度，计算相对标准差RSD。

2．1．5 稳定性试验 取各标准样品溶液，分别在0、2、4、6、8h内对其吸光度进行测定。

2．1．6 葛根素、黄芩苷、盐酸小檗碱的含量测定将提取液均浓缩至25mL，于4℃静置沉淀24h后，取上清液5mL于3 000r／min离心15min后，取上清液2mL于25mL容量瓶中，用75%乙醇补足；取稀释液分别置于相应波长下检测葛根素、黄芩苷、盐酸小檗碱的含量。

2．2 葛根、黄芩、黄连单味药有效成分的提取 称取葛根、黄芩、黄连适量，粉碎粗粉，纯水作为提取溶剂，采取煎煮法提取各单味药的有效成分［7］。以不同条件下提取的各溶液中葛根素、黄芩苷、盐酸小檗碱的含量为指标，按照正交试验L9（34）设计，考察料液比（7、9、11）、提取时间（30、60、90min）、提取次数（1、2、3）对有效成分提取率的影响，见表1。

表1 L9（34）正交设计表

2．3 提取方法的筛选 为简化提取工艺，将方中药味进行组合，以期找出可以混合提取的药味。将提取液组合后沉淀的量作为组合的依据，筛选可以组合提取的药味，以简化工艺。

2．3．1 提取液组合方法 按处方量称取葛根、黄芩、黄连、甘草分别为15g、9g、9g、6g；分别提取各味药。方法为水煎煮2次，每次1．5h。各提取液均浓缩至25mL。取各单味药提取液适量，4℃静置2 h，于3 000r／min离心15min，取上清液相互组合，每次组合时上清液均取5mL，每个组合平行测定3次。（葛根提取液为A，黄芩提取液为B，黄连提取液为C，甘草提取液为D），组合方式为：AxB，AxC，AxD，BxC，BxD，CxD，AxBxC，AxBxD，AxCxD，BxCxD，AxBxCxD

2．3．2 沉淀量的考察 将配伍后的溶液搅拌均匀，4℃静置2h，3 000r／min离心15min后用干燥至恒重的定量滤纸减压抽滤，将收集的沉淀于50℃恒温减压干燥箱中干燥36h后，取出在电子天平上测定沉淀的量。

3 结果与分析

3．1 紫外最大吸收波长的确立和标准曲线的制备

3．1．1 葛根素标准品在251±1nm处有最大吸收，标准对照品扫描图见图1。葛根素标准品溶液在251nm波长下以吸光度A对浓度C（mg／mL）绘制标准曲线，回归方程为 Abs＝0．150500C－0．015800，R2＝0．9995（n＝5）；表明葛根素在6．4～32．0μg／mL范围内有良好的线性关系，如图2。

3．1．2 黄芩苷标准品在280±1nm处有最大吸收，标准对照品扫描图见图3。黄芩苷标准品溶液在278nm波长下以吸光度A对浓度C（mg／mL）绘制标准曲线，回归方程为 Abs＝0．129063C－0．018500，R2＝0．9996（n＝5）；表明黄芩苷在6．4～32．0μg／mL范围内有良好的线性关系，如图4。

3．1．3 盐酸小檗碱标准品在266±1nm和349±1 nm处有最大吸收，且349nm处的吸收度大于266 nm处，标准对照品扫描图见图5。盐酸小檗碱标准品溶液在349nm波长下以吸光度A对浓度C（mg／mL）绘制标准曲线，回归方程为Abs＝0．058589C－0．002190，R2＝0．9997（n＝5）；表明盐酸小檗碱1．60～8．00μg／mL范围内有良好的线性关系。如图6。

3．2 精密度试验 葛根素、黄芩苷、盐酸小檗碱标准品溶液的相对标准差RSD分别为0．46%、1．07%、2．63%。

3．3 稳定性试验 葛根素标准样品溶液测定结果的RSD达到0．93% ，表明葛根素乙醇溶液至少在8h内稳定。

黄芩苷标准样品溶液测定结果的RSD达到2．01%，表明黄芩苷的乙醇溶液至少在8h内稳定。

盐酸小檗碱标准样品溶液测定结果的RSD达到1．43% ，表明盐酸小檗碱的乙醇溶液至少在8h内稳定。

3．4 葛根素、黄芩苷、盐酸小檗碱的提取

3．4．1 葛根有效成分的提取结果如表2所示。由表2得知，各因素对于提取率的影响大小依次为C B A，最优组合为A3B3C3。可见提取次数为影响葛根素提取率的最主要因素，而用水量对葛根素的提出率影响较小。从结果看，提取2次和3次葛根素提取率差别不大，考虑到时间和成本，选择A3B3C2为最佳工艺，即加11倍量水，提取两次，每次1．5h。

表2 L9（34）正交试验数据及其计算分析结果（葛根素）

3．4．2 黄芩中有效成分提取结果如表3所示。由表3得知，各因素对于黄芩苷提取率的影响大小依次为C B A，提取次数为影响黄芩苷提取率的最主要因素，最优组合为A3B3C3。从结果看，提取2次和3次黄芩苷的提取率差别不大，考虑到时间和成本，选择A3B3C2为最佳工艺，即加11倍量水，提取两次，每次1．5h。

表3 L9（34）正交试验数据及其计算分析结果（黄芩苷）

3．4．3 黄连中有效成分的提取结果如表4所示。由表4得知，各因素对于盐酸小檗碱提取率的影响大小依次为C B A，最优组合为A3B3C3。从结果可以看出，2次和3次提取对盐酸小檗碱的提取率差别不大，考虑到时间和成本，选择A3B3C2为最佳工艺，即加11倍量水，提取两次，每次1．5h。

表4 L9（34）正交试验数据及其计算分析结果（盐酸小檗碱）

3．5 提取方法的筛选结果

3．5．1 沉淀量的考察 由结果表5可以看出，ABCD项和BCD项的配伍产生的沉淀量最多。原因可能为黄芩苷为黄酮的葡萄糖醛酸苷，甘草酸为五环三萜的葡萄糖醛酸苷，均有一定的酸性，与盐酸小檗碱反应而产生沉淀，有效成分的含量有所降低；AB、AC、AD、BD、ABD组合后沉淀量产生小，有效成分减少量少。

表5 组合结果

3．5．2 提取方法的确定 从各有效成分组合后产生沉淀的情况看，尽管AB、AC、AD、BD组合产生的沉淀较少，但组合后余下的两种药物组合仍会产生较多沉淀，而ABD组合后余下的一味药物黄连单独提取不会影响其他成分的提取。因此，根据药味组合提取后的沉淀量，结合制备的简便性和节约成本、时间；确立提取方法为：葛根、黄芩、甘草合并提取，黄连单独提取。

4 讨论

4．1 在考察提取时间、料液比、提取次数对有效成分的影响时，采用紫外分光光度法测定葛根素、黄芩苷、盐酸小檗碱的含量，该方法简便、易操作，结果重现性好，可以作为单味药提取液中有效成分含量考察的方法。

4．2 影响葛根素、黄芩苷、盐酸小檗碱提取率的主要因素为提取次数，其次为提取时间，而料液比对提取率的影响不大。同时，提取液组合结果显示，葛根和黄芩、葛根和黄连、葛根和炙甘草、黄芩和炙甘草组合后沉淀量较少，黄芩和黄连、黄连和炙甘草组合后产生的沉淀量较多；因此，确定最佳的提取工艺为葛根、黄芩、炙甘草3味药混合提取，而黄连单独提取；提取工艺均为11倍量的水、提取2次、每次1．5h。

［1］ 李培生，刘渡舟．伤寒论［M］．北京：人民卫生出版社，1985：114－116．

［2］ 李宇铭．论葛根芩连汤并非表里同治［J］．光明中医，2008，23（3）：374－375．

［3］ 王立，经典方剂葛根芩连汤研究现状［J］．黑龙江医药杂志，2009，22（2）：172－173．

［4］ 李君富，尹蓉莉，李肖屹，等．正交试验优选葛根芩连汤提取工艺［J］．中国药房，2009，20（27）：2114－2116．

［5］ 张玲，徐新刚，时延增，等．紫外分光光度法测定柴黄口服液中黄芩苷的含量［J］．中草药，1997，28（2）：86－87．

［6］ 唐小明．紫外分光光度法测定清开灵注射液中黄芩苷的含量［J］．海峡药业，2001，13（1）：33－34．

［7］ 杨颖．探讨中药煎煮法［J］．中国医药导报，2009，6（10）：229．