李 淼，侯强红，蔡丝丝，李 奔，李林波，侯利兰

（1．怀化职业技术学院，湖南 怀化418000；2．湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙410128）

鸡蛔虫属于蛔目禽蛔科禽蛔属，是鸡体内最大型的一种线虫，主要寄生于肠道内而引起的一种线虫病。鸡蛔虫对鸡的危害很大，尤其是雏鸡，大量成虫寄生在小肠黏膜时，则会引起肠道堵塞、破裂以及腹膜炎，严重感染时可引起宿主死亡。鸡蛔虫病的感染呈世界性分布，主要分布在欧洲、亚洲等地，而在亚洲地区，则以中国部分地区的感染情况较为突出；其他亚洲国家也有感染的病例。

随着科学技术的发展，分子遗传学技术在寄生虫遗传变异及分类学研究上的应用日益发展，它主要是从DNA水平上研究寄生虫分类学中的一些问题。在寄生虫种群中，遗传变异十分普遍。近年来国内外许多学者利用此类方法来研究鸡蛔虫的遗传变异及分类问题［1－3］。因此，精确分析寄生虫的遗传变异对研究寄生虫的分类、鉴定及寄生虫的遗传结构均具有重要意义。

线粒体基因组具有结构简单、母系遗传、缺少重组、进化速率快等特点，特别适合作为遗传学研究的标记［4－6］。自1962年 Nass［7］等发现 mtDNA 以来，被广泛用于系统进化分析、比较和功能基因组研究等方面［8］。有鉴于此，本试验以从湖南等地的鸡只所分离的鸡蛔虫作为研究对象，PCR扩增其pcox2and pnad4并进行序列分析，为今后鸡蛔虫的分类、鉴别诊断、分子流行病学调查，以及本病的防治等更深入的研究提供基础。

1 材料与方法

1．1 虫体样品 本试验研究的12株鸡蛔虫样品分别采自长沙马王堆菜市场（MWD1－MWD3）、长沙望城菜市场（WC1－WC3）、长沙浏阳菜市场（LY1－LY3）、长沙宁乡菜市场（NX1－NX3）。

1．2 主要试剂 WizardTMDNA Clean－Up System为Promega公司产品；rTaq酶、PCR试剂、DNA Marker DL－2 000为TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司产品；蛋白酶K为天根生化科技（北京）有限公司产品。

1．3 虫体DNA的提取 从－20℃的冰箱中取出70%酒精保存的虫体，用纯净水反复吹打冲洗6次后，置于一新的1．5mL Eppendorf管中，用灭菌且经紫外灯照射过的眼科剪刀将虫体组织剪碎，然后加入200μL的GT buffer反复研磨，再加20μL蛋白酶K，混匀后，放于55℃培养箱中12～16h，其间摇动数次，使虫体组织裂解充分。将消化好的虫体悬液按WizardTMDNA Clean－Up System 使用说明书进行虫体DNA提取，将提取出的DNA于－20℃冰箱保存备用。

1．4 PCR扩增 根据GenBank：HQ704901．1公布的序列，设计特异引物，序列如下：

NAD 4F：CTTATTATTTAATTTTTTATGCTGCT，

NAD 4R：AAGCGGCTAAAGCCTTAGCATCACT；

COX2F：TTTAAGTTTGTTGTATTATTATGGTTT，

COX2F：AAAATACACCAACCACAGGAAAACT；

引物由金思瑞生物科技有限公司进行合成。扩增体系为25μL：双蒸水15．25μL、10×PCR Buffer（Mg2＋free）2．5μL、MgCl2（25mmol／L each）4 μL、dNTPs（2．5mmol／L）2μL、上 游 引 物 （100 pmol／L）0．5μL、下游引物 （100pmol／L）0．5μL、Taqpolymerase（5U／μL）0．25μL、DNA 模板1 μL；反应在Biometra循环反应仪上进行，扩增条件为：95℃预变性5min，然后94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸30s，共37个循环，最后72℃延伸5min。取3μL PCR扩增产物在0．9%TAE琼脂糖凝胶电泳，用紫外投射仪观察结果，并用凝胶成像系统摄像记录。

1．5 pcox2和pnad4序列测定及其在种系发育分析中的应用 将纯化后的PCR产物送金思瑞生物科技有限公司直接测序，测序结果用DNAStar 5．0软件进行分析。从GenBankTM检索代表性的蛔虫pcox2序列和pnad4序列与之进行相似性比对和蛔虫种系发育分析，以双盲小口线虫（Contracaecum osculatum）作为外群。利用Clustal X1．81及 Mega 4．0软件对pcox2和pnad4序列进行比对及计算遗传距离，然后用Phylip 3．67程序中的最大简约法（Maximum parasimony，MP）和 Mega 4．0程序中的临接法（Neighbor－joining method，NJ）绘制种系发育树，并用Puzzle 5．2程序构建最大似然树（Maximum Likelihood，ML）。临接法在软件默认设置下进行分析；最大简约法采用Branch and bound模型分析，采用自展检验（bootstrap test）估算所构建系统树的可靠性，ML法采用Hky替代模型和Quartet puzzling搜索程序进行分析，复制数均 为 1 000。 同 时 利 用 DNAStar 5．0 中 的MegAlign程序进行相似性分析。

2 结果及分析

2．1 PCR扩增结果 12个样品均成功地扩增出约350bp（pcox2）和400bp（pnad4）图1的片段，与预期目的片段长度相符，且无非特异性条带，空白对照为阴性。

2．2 测序结果及分析 测序结果显示，由引物COX2和NAD4扩增的鸡蛔虫pcox2和pnad4片段大小分别为290～310bp和340～360bp，对12条鸡蛔虫pcox2和pnad4序列进行了种内比较，结果显示，12个不同个体间的pcox2和pnad4序列的差异为0．0%～2．0%和0．0%～3．3%；其样品差异主要是存在碱基置换和颠换现象。12个分离株pcox2相差6bp、pnad4相差16bp；各长沙分离株之间相应pcox2序列的相似性在98%以上、pnad4序列相似性在96%以上。长沙分离株与基因库中其他蛔虫pcox2序列的相似度均低于88% 、pnad4序列的相似度均低于79% 。从碱基组成来分析，12个分离株pcox2的G＋C含量最高为36．14%；A＋T含量最低为63．86%、pnad4的G＋C含量最高为31．48%；A＋T含量最低为68．52% 。

2．3 cox2和nad4序列系统发生树 通过种系发育分析显示，利用 Mega 4．1的 NJ法构建了种系发育树，长沙分离株具有高度同源性（A1－3，B1－3，C1－3，D1－3），长沙分离株位于同一分枝，系统发生树中的Bootstrap值较高，长沙分离株所属分枝与其他蛔虫所属分支相隔较远，得到了很好地鉴别见图2。

3 讨论

本试验结果显示，各湖南分离株之间相应序列的相似性均在98%（COX2）和96%（NAD4）以上，湖南分离株与基因库中其他蛔虫相似度均低于88%（COX2）和79%（NAD4）。17个湖南分离株cox2和nad4序列种间的变异远远大于种内的变异，说明cox2和nad4均能为种间的遗传变异提供遗传标记，可用于鸡蛔虫的鉴定。采用3种不同方法构建的进化树具有一致性，均显示出湖南分离株位于同一分枝，系统发生树中的Bootstrap值较高，与D．latum的关系最近。湖南分离株所属分枝与其他蛔虫所属分支相隔较远，得到了很好地鉴别。本项试验结果表明，鸡蛔虫的cox2和nad4序列种内相对保守，种间差异大，说明cox2和nad4序列能作为鸡蛔虫的遗传标记用于鸡蛔虫的鉴定。本试验结果为鸡蛔虫的分类鉴定以及进一步的分子流行病学调查和群体遗传研究提供了基础。

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［5］ Gasser R B ，Newton S E．Genomic and genetic research on bursate nematodes：significance ，implications and prospects［J］．Int J Parasitol，2000，30：509－534．

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