陈 孟，杨会成，周宇芳，廖妙飞，马华威，郑 斌*

（1.浙江海洋学院，浙江 舟山 316000；2.浙江省海洋开发研究院，浙江 舟山 316100）

胶原蛋白多肽是胶原或明胶经蛋白酶等降解处理后制得的具有较高消化吸收性、分子量约为2000u～30000u的产物，不具有明胶的凝胶性能。目前市场上的胶原几乎都是胶原多肽[1]。在20世纪60、70年代就有学者研究发现，小的肽段和氨基酸能够促进锌元素的吸收[2-4]。锌是人体必需的微量元素之一，也是体内多种重要酶的组成成分和酶的激活剂[5]。研究证明，胶原蛋白多肽螯合锌具有提高饲料利用率、改善动物生产性能、促进锌和其他矿物元素的吸收以及促进动物生长发育、抗氧化和提高动物机体免疫力等作用，是理想的补锌剂[6-7]。因此，开展胶原蛋白多肽与锌最优螯合工艺条件的研究，可以为今后工业化生产奠定基础。

本试验采用响应面法对鱼皮胶原蛋白多肽与锌的螯合工艺进行优化，重点分析研究了鱼皮胶原肽与硫酸锌的质量比、螯合时间、螯合温度、酸碱度等因素对螯合率响应值的影响及变化规律，并对螯合物进行紫外光谱学分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鱼皮胶原蛋白多肽：由浙江海力生生物科技有限公司提供；硫酸锌、茚三酮、无水乙醇、氢氧化钠等所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

CR21G型高速冷冻离心机：日本日立公司；85-1型恒温磁力搅拌器：国华电器有限公司；DECTA320A/C型pH计：瑞士梅特勒托利多公司；HHS型电热恒温水浴锅：上海棱光技术有限公司；UV-2102C型紫外可见分光光度计：上海尤尼珂仪器有限公司；TD3102型台式电子天平：余姚金诺天平仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鱼皮胶原肽与锌的螯合工艺[8-11]

粉状鱼皮胶原蛋白多肽→加水溶解→搅拌调pH值→按比例加入硫酸锌→搅拌控温螯合→过滤→浓缩→加入无水乙醇析出沉淀→抽滤→洗涤→真空冷冻干燥→胶原肽锌螯合物

1.3.2 鱼皮胶原肽与锌螯合率的测定[12-14]

准确量取10mL胶原肽锌螯合物的浓缩液，并定容于100mL容量瓶中，摇匀备用。然后采用EDTA络合滴定法测定螯合液中微量元素锌的总量。另在100mL烧杯中移入10mL胶原肽锌螯合物浓缩液，加热浓缩至尽干，然后加入50mL无水乙醇，水浴温热并充分搅拌。将上述混合液用高速冷冻离心机离心分离，所得沉淀用水溶解定容于100mL容量瓶中，摇匀，用EDTA络合滴定法测定螯合态中微量元素锌的含量。EDTA络合滴定法：用移液管准确移取25mL待测液于250mL锥形瓶中，加入50mL水，滴加2～3滴二甲酚橙指示剂，用预先配制好的0.02mol/L EDTA标准溶液滴定，溶液颜色由紫红变为亮黄色即为滴定终点。

式中：C为EDTA溶液的浓度，mol/L；V1为滴定螯合态锌所消耗的EDTA溶液体积，mL；V0为滴定初始态锌的总量所消耗的EDTA溶液体积，mL。

1.3.3 响应面优化试验设计[15-16]

本试验将胶原蛋白多肽液质量分数固定于3%的条件下，以螯合率为响应值，选取肽锌质量比（X1）、时间（X2）、温度（X3）、pH值（X4）为自变量，采取统计分析软件建立4因素3水平的Box-Behnken模型，对鱼皮胶原蛋白多肽与金属离子螯合反应进行响应面优化设计。变量因素编码及水平见表1。

表1 响应面因素编码及水平Table 1 Factors and levels of response surface design

1.3.4 胶原蛋白多肽锌螯合物的紫外光谱扫描分析

分别对胶原蛋白多肽螯合锌、胶原蛋白多肽溶液和硫酸锌溶液进行紫外全波长扫描，通过比较三者之间最大吸收波长是否发生位移或者有新的吸收峰产生，间接来说明是否有新的物质生成。

2 结果与分析

2.1 中心组合试验设计结果

根据Box-Behnken的中心组合设计原理，每组试验重复3次取其平均值，并采用统计分析软件Design-Expert7.0对试验数据进行响应面分析，响应面试验参数设计与结果见表2。

对试验数据进行回归拟合后，得到螯合率（Y）的回归方程为：

表2 响应面试验参数设计与结果Table 2 Design of technical parameter and results of response surface design

对回归模型进行方差分析，结果见表3。

从表3螯合率回归模型方差分析中显著性检验结果可以看出，模型回归p＜0.0001显著，失拟项p＞0.05不显著，该模型R2=0.9786，说明模型与实际试验拟合程度较好。预测值与实测值之间存在较好的相关性，试验误差小，自变量与响应值之间线性关系显著，可以用于胶原蛋白多肽螯合锌工艺实验的分析和预测。另外，表3方差分析结果也表明，pH值、肽锌质量比和时间3个因素在试验过程中均起主要作用，对方程影响显著程度由大到小依次为pH值、肽锌质量比、时间和温度，其中pH值和肽锌质量比对方程影响最为显著，说明这二者直接关系螯合率的大小，而温度的影响在一定范围内并不是很显著。经方差分析得：X4、X12、X32和X42项极显著；X1、交互项X1X3对模型的影响较为显著；X2、X22项对实验的影响也达到了显著水平，可知各因素之间不是简单的线性关系，而是二次关系。

表3 螯合率回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model of chelating rate

2.2 响应面结果分析

由Design-Expert7.0软件处理中心设计实验得到响应面分析结果见图1～6。图1～图6的极值点明显，能够直观地看出试验设计的各个因素及其相互间的交互作用对胶原蛋白多肽锌螯合率的影响，便于参考比较。

图1 肽锌质量比与时间互作用等高线和响应面图Fig.1 Response surface and contour plots of interactions between peptide-zinc mass ratio and time

图2、图6表明，温度对胶原蛋白多肽锌螯合率的影响显著性不大而肽锌质量比和pH值对螯合率的影响较为显著。过高或过低的肽锌质量比和pH值都会使胶原蛋白多肽锌螯合率降低，其中pH值的影响更为显著，肽锌质量比和pH值存在一个最适值。图1、图3、图5中等高线呈椭圆形，表示肽锌质量比、时间和pH值两两因素之间交互作用显著。图4表明时间和温度对胶原蛋白多肽锌螯合率的影响均不太显著，与方差分析结果相吻合。

图2 肽锌质量比与温度互作用等高线和响应面图Fig.2 Response surface and contour plots of interactions between peptide-zinc mass ratio and temperature

表3 肽锌质量比与pH互作用等高线和响应面图Fig.3 Response surface and contour plots of interactions between peptide-zinc mass ratio and pH

图4 时间与温度互作用等高线和响应面图Fig.4 Response surface and contour plots of interactions between time and temperature

图5 时间与pH互作用等高线和响应面图Fig.5 Response surface and contour plots of interactions between time and pH

图6 温度与pH互作用等高线和响应面图Fig.6 Response surface and contour plots of interactions between temperature and pH

2.3 响应面结果验证性实验

由模型方程计算可得，最佳螯合工艺条件为肽锌质量比2.8∶1，时间33.2min，温度40.1℃，pH7.3，在此条件下螯合率为67.25%，与响应面模型预测值67.36%极为接近。这说明该回归模型能较好地反映胶原蛋白多肽螯合锌生成量的变化规律，可以为实际操作提供良好的指导。

2.4 紫外扫描结果

图7 硫酸锌紫外扫描图Fig.7 UV spectrum of zinc sulfate

图8 胶原蛋白多肽紫外扫描图Fig.8 UV spectrum of collagen peptide

图9 胶原蛋白多肽螯合锌紫外扫描图Fig.9 UV spectrum of collagen peptide-zinc chelate

由图7～图9可以看出，胶原蛋白多肽螯合锌的紫外扫描图与胶原蛋白多肽和硫酸锌的在吸光度强弱和位置上都有所不同，胶原肽螯合锌样品在波长379nm附近出现新的吸收峰，说明胶原蛋白多肽螯合锌是一种新产生的物质。

3 结论

本试验以响应面分析法对鱼皮胶原蛋白多肽与金属离子锌的螯合工艺条件进行优化，最佳螯合工艺条件为肽锌质量比2.8∶1，时间33.2min，温度40.1℃，pH7.3。在此条件下螯合率为67.25%，与响应面模型预测值67.36%非常接近，说明响应面模型可以很好的应用于胶原肽锌螯合工艺条件的优化。由紫外光谱分析初步可知，胶原蛋白多肽螯合锌与胶原蛋白多肽和硫酸锌的紫外扫描图均不同，是一种新型螯合物。

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